Токсиколого-гигиеническая характеристика бентонитовом наноглины, применяемом в пищевом промышленности

Резюме

В настоящее время бентонитовая наноглина (НГ), получаемая из природного осадочного минерала бентонита и содержащая более 90% монтмориллонита, широко используется в пищевой промышленности в качестве технологических вспомогательных средств - адсорбентов при очистке растительных масел и производстве напитков. Глинистые минералы применяются также в качестве пищевых добавок и компонентов композитных упаковочных материалов.

В исследованиях in vitro различные формы НГ проявляли цитотоксичность в отношении ряда клеточных линий, а имеющиеся данные о пероральной токсичности НГ in vivo противоречивы.

Цель настоящего исследования - оценка острой пероральной токсичности НГ и ее токсиколого-гигиеническая характеристика в подостром 92-суточном эксперименте на крысах линии Вистар при ежедневном пероральном поступлении в дозах 1, 10 и 100 мг на 1 кг массы тела.

Материал и методы. Острую токсичность НГ оценивали на 8 самцах и 8 самках крыс с исходной массой тела 236±10 и 203±10 г соответственно. НГ вводили в виде водной дисперсии внутрижелудочно через зонд в дозе 5,0 г на 1 кг массы тела. По окончании эксперимента на 14-е сутки выполняли обзорное патологоанатомическое исследование органов грудной клетки и брюшной полости. Подострый эксперимент проведен на 64 крысах-самцах с исходной массой тела 117±7 г. У крыс оценивали уровень тревожности и функцию памяти, используя тест "Условный рефлекс пассивного избегания". На 90-е сутки изучали уровень экскреции креатинина и селена с суточной мочой. По окончании эксперимента у животных оценивали интегральные показатели, состояние барьерной функции желудочно-кишечного тракта, в крови исследовали гематологические и биохимические показатели, в печени определяли содержание небелковых тиолов и количество клеток в апоптозе, в содержимом слепой кишки изучали состояние культивируемых популяций микробиома.

Результаты. Изучение острой токсичности НГ показало отсутствие гибели крыс и специфических патологических изменений во внутренних органах в дозе 5 г на 1 кг массы тела, что позволило отнести НГ к V классу опасности. Тем не менее в условиях 92-суточного эксперимента НГ оказывала некоторые неблагоприятные биологические воздействия на организм крыс. Так, уже при ее дозе 1 мг на 1 кг массы тела наблюдалось резкое угнетение роста симбиотической бифидофлоры, возрастание количества тромбоцитов, повышение содержания липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и отношения ЛПНП/липопротеины высокой плотности (ЛПВП) вместе с наличием у животных гипертригли-церидемии. При дозе 10 мг на 1 кг массы тела было установлено увеличение массы селезенки и снижение коэффициента де Ритиса аспартат-/аланинаминотрансфераза (АСТ/АЛТ), при дозе 100 мг на 1 кг массы тела - сдвиги в лейкоцитарной формуле крови, избыточный рост энтерококков в слепой кишке, статистически значимо повышенная масса тела животных, снижение АСТ/АЛТ и уровня азотистых метаболитов сыворотки крови, косвенно свидетельствующего о торможении катаболических процессов. Вместе с тем наибольшая доза НГ блокировала кишечное всасывание белкового антигена - овальбумина.

Заключение. Проведенные исследования показали, что НГ проявляет различные токсические и нетоксические эффекты воздействия на организм в основном при дозе 100 мг на 1 кг массы тела, тем не менее ее максимальная недействующая доза (NOAEL) при ежедневном пероральном 92-дневном поступлении составляет, по-видимому, менее 1 мг на 1 кг массы тела.

Ключевые слова:наноглина, монтмориллонит, пероральная токсичность, класс опасности, максимальная недействующая доза, микробиом

Финансирование. Работа выполнена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы фундаментальных научных исследований (тема Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 0529-2019-0057).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для цитирования: Шипелин В.А., Шумакова А.А., Мусаева А.Д., Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Маркова Ю.М., Быкова И.Б., Масютин А.Г., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Токсиколого-гигиеническая характеристика бентонитовой наноглины, применяемой в пищевой промышленности // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 3. С. 71-85. DOI: 10.24411/0042-8833-2020-10031

Глины (филлосиликаты, слоистые алюмосиликаты) находят разнообразное применение в пищевой промышленности. Благодаря способности пластинок глины блокировать диффузию молекул газов, полимерные композиты, содержащие органически модифицированные глины, применяются при производстве газобарьерных упаковочных материалов [1]. В значительных количествах глины используются в качестве технологических вспомогательных средств - адсорбентов при очистке растительных масел и производстве напитков [2, 3]. Такие виды глинистых минералов, как алюмосиликаты натрия, калия и кальция (Е554-Е556), бентонит (Е558) и каолин (Е559) относятся к числу разрешенных пищевых добавок1. Потребление в пищу так называемой съедобной глины широко распространено в ряде африканских стран [4] и рассматривается как средство профилактики энтеральных инфекций и афлатоксикозов [5]. Существуют разработки по использованию глин в качестве носителей для пероральной доставки лекарственных средств [6] и витаминов [7].

1 ТР ТС 029/2012 "Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств", приложение 2.

В результате модификации катионными поверхностно-активными веществами и (или) интенсивной механической обработки (ультразвук) происходит расщепление (эксфолиация) объемных глинистых минералов на индивидуальные алюмосиликатные пластины толщиной <2 нм [8]. Такой вид продукции рассматривается как наноматериал, за которым закреплен термин "наноглина" (НГ). Поперечный диаметр нанопластин НГ может находиться как в нанодиапазоне (<100 нм), так и значительно превосходить его. Известна также модификация галуазитовой НГ, представленная нанотрубками [9].

По данным многочисленных исследований, различные формы НГ обладают цитотоксичностью в отношении большого числа линий как нормальных, так и трансформированных клеток животных и человека [10]. Имеются данные о наличии у НГ пероральной токсичности [11]. В отдельных работах показано наличие у них прооксидантных свойств [12] и генотоксичности [13], а также неблагоприятное влияние на состав и функциональную активность кишечного микробиоценоза [14]. Это создает источник потенциального риска для здоровья человека при поступлении с пищей НГ или их остаточных количеств, мигрировавших из упаковки или технологических вспомогательных средств.

Цель настоящего исследования - выявление биологических эффектов и установление максимальной недействующей дозы для образца НГ, производимого российской промышленностью и рекомендованного к использованию в качестве технологического вспомогательного средства, в остром и подостром 92-суточном экспериментах на крысах при пероральном пути поступления.

Материал и методы

Используемый наноматериал

В работе использовали бентонитовую НГ "Монамет 1Н1®" (АО "МЕТАКЛЭЙ", Россия). Согласно спецификации производителя, НГ была получена путем химической и физико-химической обработки природного осадочного минерала бентонита, содержит >90% монтмориллонита и <1% механических примесей (кремнезема, кварцевого песка и др.). Для приготовления дисперсий НГ использовали деионизованную воду из установки "Milli-Q" (Merck, Германия). Диспергирование осуществляли в течение 20 мин на погружном ультразвуковом (УЗ) процессоре с охлаждением, при средней мощности 2 Вт/см3. Приготовленную суспензию вводили внутрижелудочно и в рацион не более чем через 30 мин после УЗ-обработки.

Электронно-микроскопическое исследование водных дисперсий НГ выполняли на электронном микроскопе JEM-2100 (Jeol, Япония) с возможностью измерений методом энергодисперсионной микроспектрометрии (ЭДМС) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Характеристику размера частиц дисперсии НГ методом динамического рассеяния света осуществляли на приборе "Nanotrack Wave" (Microtrac Inc., США) с использованием пакета программ FLEX 11.0.0.1.

Дизайн биологического эксперимента

В исследованиях использовали крыс линии Вистар, полученных из питомника "Столбовая" ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России". Работу выполняли в соответствии с Правилами надлежащей лабораторной практики.

В эксперименте № 1 по изучению острой токсичности использовали 8 самцов и 8 самок крыс с исходной массой тела 236±10 и 203±10 г соответственно. После недельной адаптации к условиям вивария крысам вводили НГ в виде водной дисперсии концентрацией 10 мас. % внутрижелудочно через зонд, двукратно с 2-часовым интервалом в суммарной дозе 5,0 г на 1 кг массы тела. Наблюдение за состоянием животных осуществляли в течение 6 ч после введения НГ и далее ежесуточно на протяжении 13 сут в соответствии с ГОСТ 32644 "Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности". Животных выводили из эксперимента на 14-е сутки путем ингаляции CO2 и выполняли обзорное патологоанатомическое исследование органов грудной клетки и брюшной полости.

В эксперименте № 2 по изучению подострой токсичности использовали 4 группы по 16 самцов крыс исходной массой 80±10 г. После недельной адаптации крысы 1-4-й групп в течение последующих 92 сут получали полусинтетический сбалансированный рацион по AIN-93 с добавлением водной дисперсии НГ в расчетных дозах 0 (контроль); 1; 10 и 100 мг на 1 кг массы тела в условиях неограниченного доступа. Количество потребленного корма регистрировали ежедневно и при необходимости корректировали содержание НГ в рационе для поддержания ее стабильной дозы. Воду для питья получали в установке обратного осмоса "Milli-RO" (Waters, США).

В ходе наблюдения ежедневно оценивали общее состояние животных; массу тела определяли с недельными интервалами. На 65, 66 и 86-е сутки опыта оценивали уровень тревожности и когнитивную функцию, используя тест "Условный рефлекс пассивного избегания" (УРПИ) в соответствии с [15]. Сбор суточной мочи выполняли на 90-е сутки опыта, помещая животных в метаболические клетки.

Животных выводили из эксперимента на 93-и сутки после 16-часового голодания путем обескровливания из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. За 3 ч до эвтаназии крысам вводили внутрижелудочно через зонд куриный овальбумин (ОВА) в дозе 2 г на 1 кг массы тела. На секции определяли массу внутренних органов (печень, почки, селезенка, сердце, легкие, тимус, надпочечники, головной мозг), отбирали кровь для исследования концентрации антигенного ОВА, гематологических и биохимических показателей, печень для определения содержания небелковых тиолов и количества клеток в апоптозе. Содержимое слепой кишки асептически собирали в стерильные бакпечатки для микробиологического исследования.

Содержание антигенного ОВА в сыворотке крови определяли с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного теста [16]. Всасывание ОВА в кровь (в процентах от введенной дозы) рассчитывали исходя из предположения, что масса крови крысы составляет 6% массы тела, и с учетом величины гематокрита.

Гематологические показатели определяли в цельной крови стандартными методами на гематологическом анализаторе "Coulter AC TTM 5 diff OV" (Beckman Coulter, США) с набором реагентов (Beckman Coulter, Франция). Апоптоз клеток печени изучали на проточном цитофлуориметре "FC 500" (Beckman Coulter International S.A., Австрия) с использованием технологии окрашивания гепатоцитов в суспензии флуоресцентными реагентами FITC-аннексином V и 7-аминоактино-мицином (7-AAD) [17].

В сыворотке крови определяли биохимические показатели [(содержание глюкозы, холестерина общего и липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), триглицеридов, общего белка, альбуминов, мочевины, мочевой кислоты, активности трансаминаз-аланин-(АЛТ) и аспартат-аминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы)] по стандартным методикам на биохимическом анализаторе "Konelab 20i" (Финляндия); активность глутати-онпероксидазы - спектрофотометрическим методом, согласно [18], с незначительными модификациями. Содержание в печени восстановленного глутатиона определяли спектрофотометрическим методом с 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислотой (реактив Эллмана) [20]. Содержание креатинина в моче определяли спектрофотометрическим методом с пикриновой кислотой, селена - спектрофлуориметрическим методом с 2,3-диаминонафталином [20].

При оценке состояния микробиоты слепой кишки содержание бифидобактерий определяли на среде ГМК; лактобацилл - на MRS-агаре; энтеробактерий - на среде Эндо, цитратассимилирующих энтеробактерий - на цитратном агаре Симмонса, Staphylococcus spp. - на агаре Байрд-Паркера; Enterococcus spp. - на азидном агаре с канамицином и эскулином; Bacteroides spp. - на желчно-эскулиновом агаре для бактероидов; дрожжей и плесневых грибов - на среде Сабуро с хлорамфениколом (0,1 г/л). Инкубирование анаэробных микроорганизмов осуществляли с использованием пакетов для химического связывания кислорода "Oxoid™ AnaeroGen™" (Thermo Scientific, США). Количество микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г сырой массы содержимого слепой кишки.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета SPSS 20.0. Расчет включал определение выборочного среднего, стандартной ошибки. Величины, не имеющие нормального распределения (содержание микроорганизмов), характеризовали медианой и интервалами изменения. Вероятность принятия нуль-гипотезы о совпадении распределений сравниваемых выборок устанавливали согласно критерию Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и ANOVA. Достоверность различий долевых показателей оценивали с использованием критерия χ2.Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты

Характеристика наноматериала

Электронно-микроскопическое исследование препарата НГ (рис. 1) показало его морфологическую гетерогенность с наличием, по крайней мере, трех типов структур: 1) нанопластин очень малой (заведомо менее 10 нм) толщины и диаметром как более (см. рис. 1, А), так и менее 100 нм (см. рис. 1, Б); 2) наночастиц формы, близкой к сферической, диаметром 50-100 нм (см. рис. 1, В, Г) и 3) стержневидных структур диаметром около 50 нм и аспектным соотношением 10:1 или более (см. рис. 1, Б, В, Г). Качественная оценка химического состава материала методом спектров ЭДМС показала характерные для комплексного природного алюмосиликата пики кремния, алюминия, калия, кислорода, хлора, а также следовые количества кобальта и меди (последняя, возможно, является артефактом, связанным с использованием при монтаже образца медных сеток) (см. рис. 1, Д). Исследование методом динамического рассеяния света выявило полимодальное распределение по гидродинамическому диаметру различных агрегатов частиц в водной суспензии образца с максимумами при 333, 937, 1740 и более 6000 нм (см. рис. 1, Е). Таким образом, исследованный образец может рассматриваться как гетерогенный наноматериал, содержащий алюмосиликатные нанообъекты (наночастицы, нанопластины, нанотрубки/наностержни), что совпадает с характеристиками НГ, известными из литературы [8-10].

Рис. 1. Характеристика препарата бентонитовой наноглины

А-Г - электронные микрофотографии частиц наноглины, осажденных на подложке из формвара, смонтированной на медной сетке, микроскоп JEM-2100 (Jeol, Япония), напряжение 80 кВ, увеличение ×32 000 (А), ×40 000 (Б-Г); Д - спектр ЭДМС от образца наноглины; E - распределение частиц наноглины по гидродинамическому диаметру по данным динамического рассеяния света.

Fig. 1. Characterization of the bentonite nanoclay preparation

A-D - electron micrographs of nanoclay particles deposited on a substrate from formwar mounted on a copper grid, JEM-2100 microscope (Jeol, Japan), voltage 80 kV, magnification ×32 000 (A) ×40 000 (B-D); E - EDX spectrum from a nanoclay sample; F - the distribution of bentonite nanoclay particles by the hydrodynamic diameter according to the DLS data.

Оценка острой токсичности наноглины

В результате однократного введения НГ в дозе 5,0 г на 1 кг массы тела гибели крыс (как самцов, так и самок) не наблюдали. В первые 1-3 ч после введения у части животных обеих групп наблюдали снижение подвижности, учащенное и более глубокое, чем обычно, дыхание, что, по-видимому, было неспецифической реакцией, обусловленной большим объемом вводимой внутрижелудочно жидкости и ее высокой вязкостью при данной концентрации НГ. Впоследствии на протяжении 13 сут все животные имели нормальный внешний вид, стул, аппетит, были подвижными, прибавляли в массе тела. Патологоанатомическое исследование на 14-е сутки не выявило специфических патологических изменений во внутренних органах, за исключением гранулематозных новообразований одного (в 2 случаях) и двух (в 1 случае) яичников у самок крыс, что в целом характерно для животных данной линии и возраста. Таким образом, среднелетальную дозу (LD50) для НГ в данном эксперименте количественно установить не представилось возможным; во всяком случае ее величина, превосходит 5 г на 1 кг массы тела, что позволяет отнести НГ к классу малоопасных веществ (V класс опасности)2.

2 ГОСТ 32644. Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Острая пероральная токсичность - метод определения класса острой токсичности.

Биологические эффекты наноглины при подостром пероральном введении

На протяжении эксперимента крысы всех четырех групп имели нормальный внешний вид, аппетит, двигательную активность, стул; летальность и заболеваемость не отмечены. Фактически потребленные дозы НГ в группах животных стабильно поддерживались на протяжении эксперимента (рис. 2, А). Вместе с тем уже с первых недель кормления крысы, получавшие НГ в максимальной дозе (100 мг на 1 кг массы тела), статистически значимо быстрее прибавляли в массе тела (рис. 2, Б), несмотря на практически идентичную пищевую и энергетическую ценность опытных рационов. Изучение показателей тревожности, краткосрочной и долгосрочной памяти в тесте УРПИ (табл. 1) показало, что у крыс 4-й группы, получавшей максимальную дозу НГ, отмечалось некоторое снижение времени латенции захода в темное отделение установки, что может указывать на повышение тревожности, однако данное различие было статистически незначимым (p>0,1). Достоверных различий в показателях краткосрочной и долгосрочной памяти также не выявлено.

Таблица 1. Результаты тестирования поведенческих реакций крыс в тесте "Условный рефлекс пассивного избегания"

Table 1. Test results of rats' behavioral reactions in passive avoidance reaction test

Рис. 3. Индивидуальные значения концентрации антигенного куриного овальбумина в крови крыс (А), удельной экскреции селена (Б), содержания восстановленных тиолов в печени (В)

- различие с 1-й группой статистически значимо, p<0,05, критерий Манна-Уитни.

Fig. 3. Individual values of absorpti on of antigenic ovalbumin in rat blood (A), specific excretion of selenium (B), and content of reduced thiols in the liver (C)

- the difference with 1st group is significant, p<0.05, Mann-Whitney test.

Определение кишечного всасывания макромолекул ОВА (рис. 3, А) показало отсутствие различий по этому показателю в пределах групп крыс с 1-й по 3-ю; измеренные уровни антигенного ОВА были типичными для животных данного возраста. Однако в 4-й группе, получавшей НГ в максимальной дозе (100 мг на 1 кг массы тела), антигенный ОВА в крови не был выявлен в пределах чувствительности метода (~0,5 нг/мл) ни у одной из 10 протестированных крыс, что отвечает статистически значимому (p<0,001, U-критерий Манна-Уитни) снижению по сравнению с контролем.

Для интегральных показателей крыс при выведении из эксперимента (табл. 2) было характерно дозозависимое статистически значимое (p<0,002, ANOVA) повышение относительной массы селезенки, начиная с дозы НГ 10 мг на 1 кг массы тела.

Таблица 2. Интегральные показатели (M±m) крыс на 93-и сутки эксперимента

Table 2. Integral indices (M±m) of rats on the 93rd day of the experiment

У животных, получавших НГ в дозе 100 мг на 1 кг массы тела, также отмечалось статистически значимое возрастание абсолютной массы тела и небольшое, но статистически значимое снижение относительной массы головного мозга.

Анализ гематологических показателей (табл. 3) показал отсутствие влияния НГ на состояние эритроцитов, за исключением тенденции (p=0,054, ANOVA) к снижению среднего объема клеток в 3-й группе. Различия в лейкоцитарной формуле крови были более существенными: в 4-й группе, при дозе НГ 100 мг на 1 кг массы тела достоверно возрастало количество лимфоцитов и базофилов и снижалось - нейтрофилов (p<0,016, ANOVA). Небольшое по абсолютной величине, но статистически значимое возрастание количества тромбоцитов отмечалось только во 2-й группе при наименьшей дозе НГ.

Таблица 3. Гематологические показатели (M±m) крыс на 93-и сутки эксперимента

Table 3. Hematological parameters (M±m) of rats on the 93rd day of the experiment

Потребление крысами НГ не оказывало достоверного влияния на апоптоз клеток печени (данные не показаны). Количество живых клеток, клеток на ранней и поздней стадии апоптоза и мертвых клеток во всех 4 группах животных соответствовало ранее установленной внутрилабораторной норме [17]. НГ также не оказывала влияния на содержание восстановленных тиолов в ткани печени (рис. 3, В). Оценка статуса селена по его удельной (в расчете на содержание креатинина) экскреции с мочой (см. рис. 3, Б) показало аномальное возрастание этого показателя у 3 из 8 протестированных животных в 3-й группе (доза 10 мг на 1 кг массы тела). У остальных 5 животных этой группы экскреция не отличалась от контроля. Активность селен-зависимой глутатионперок-сидазы эритроцитов в данной группе крыс не изменялась по сравнению с контролем (1-я группа: 0,364±0,020; 2-я группа - 0,428±0,021; 3-я группа - 0,370±0,018; 4-я группа - 0,359±0,018 мкмоль/мин на мг белка; p>0,05 ANOVA по фактору "доза"). Можно заключить, что убедительных свидетельств нарушения статуса селена под действием НГ не получено.

Определение биохимических показателей плазмы крови крыс показало отсутствие влияния НГ в дозах до 100 мг на 1 кг массы тела включительно на уровни глюкозы, общего холестерина и холестерина ЛПВП, общего белка, альбумина, глобулинов, активности АЛТ и щелочной фосфатазы (p>0,1, ANOVA во всех указанных случаях). Средний уровень триглицеридов в плазме крыс во 2-й группе при наименьшей дозе НГ составил 1,42±0,21 ммоль/л и был на 60% выше, чем в контроле (0,89±0,12 ммоль/л, p<0,05, U-критерий Манна-Уитни). Соответственно, в этой группе расчетное содержание липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и отношение ЛПНП/ЛПВП было статистически значимо выше. В 3-й и в 4-й группах все показатели липидного обмена значимо от контроля не отличались. Активность АСТ во всех группах животных не выходила за пределы нормальных значений, но была достоверно снижена в сравнении с контролем при дозах НГ 10 и 100 мг на 1 кг массы тела (рис. 4, А). Для этих же двух групп было характерно достоверное снижение коэффициента де Ритиса (АСТ/АЛТ) [21] (рис. 4, Б) и уровня мочевой кислоты (рис. 4, В). Содержание креатинина было незначительно по абсолютной величине, но статистически значимо снижено во всех группах крыс, получавших НГ (рис. 4, Г); данный показатель не выходил за пределы интервала нормы. В совокупности полученные данные указывают на признаки угнетения катаболизма белка под действием НГ, по крайней мере при двух более высоких ее дозах.

Рис. 4. Активность аспартатаминотрансферазы (А), отношение активности аспартат-/аланинаминотрансферазы (коэффициент де Ритиса) (Б), концентрация мочевой кислоты (В) и креатинина (Г) в сыворотке крови крыс

* - различие с 1-й группой (контроль) статистически значимо, p<0,05, критерий Манна-Уитни; горизонтальная скобка - распределение в группах неоднородно, p<0,05, ANOVA.

Fig. 4. AsAT activity (A), AsAT/AlAT activity ratio (de Ritis coefficient) (B), uric acid (C) and creatinine (D) level in rat serum

* - the difference with 1st group (control) is significant, p<0.05, Mann-Whitney test; horizontal bracket - the distribution in groups is heterogeneous, p<0.05, ANOVA.

Результаты анализа основных и транзиторных компонентов микробиома слепой кишки (табл. 4) показывают, что потребление НГ во всем изученном интервале доз приводит к угнетению роста бифидофлоры (p=0,016, критерий Краскела-Уоллиса). При наибольшей дозе (100 мг на 1 кг массы тела) также наблюдается повышенный рост энтерококков (статистически значимый) и гемолитических аэробных микроорганизмов (на уровне тенденции, p=0,068, критерий Краскела-Уоллиса).

Таблица 4. Показатели микробиоценоза слепой кишки крыс на 93-и сутки эксперимента, Ме (min-max)

Table 4. Indices of the cecum microbiocenosis in rats on the 93rd day of the experiment Me (min-max)

П р и м е ч а н и е. Статистически значимое (p<0,05) отличие согласно критерию Манна-Уитни: * - от показателя 1-й группы (контроль).

N o t e. * - the difference with 1st group was significantly p<0.05.

Обсуждение

Как показало проведенное исследование, использованный образец бентонитовой НГ при пероральном введении крысам практически не обладает острой токсичностью (вещество V класса опасности), но способен оказывать ряд биологических воздействий на организм крыс при подостром 92-суточном введении, причем некоторые из этих воздействий могут быть охарактеризованы как неблагоприятные (токсические). Так, уже при дозе 1 мг на 1 кг массы тела наблюдается резкое угнетение роста полезной симбиотической бифидофлоры, что качественно совпадает с данными работы [14], в которой отмечалось снижение ее функциональной активности; при дозе 10 мг на 1 кг массы тела и более выявлено увеличение массы селезенки, при дозе 100 мг на 1 кг массы тела - сдвиги в лейкоцитарной формуле крови, избыточный рост энтерококков в слепой кишке. При этой же дозе НГ наблюдается более высокая масса тела животных, снижение коэффициента де Ритиса (АСТ/АЛТ), уровня азотистых метаболитов сыворотки крови, что может свидетельствовать о торможении катаболических процессов [22]. С другой стороны, при наибольшей из доз НГ практически полностью блокируется кишечное всасывание модельного белкового антигена - ОВА. Полученный результат согласуется с данными исследований, в которых была показана способность НГ снижать кишечную абсорбцию различных токсических веществ [5]. Подобные эффекты обычно связываются с наличием у глин сорбционных свойств. Однако для выяснения действительных причин влияния НГ на барьерную функцию кишки необходимо проведение дополнительных, в частности морфологических, исследований.

При минимальной дозе НГ отмечалось наличие у животных гипертриглицеридемии, что, однако, не получило подтверждения при более высоких дозах.

Основным ограничением в интерпретации полученных данных является гетерогенность образца НГ по морфологии частиц, что не позволяет связать выявленные эффекты с действием определенного типа представленных алюмосиликатных нанообъектов (наночастиц, нанопластин или нанотрубок). Однако использованный образец представляет собой коммерческий препарат НГ, применяемый на практике в качестве технологического вспомогательного средства, ввиду чего его токсиколого-гигиеническая характеристика релевантна задаче обеспечения безопасности потребляемой человеком пищевой продукции, полученной с помощью НГ.

В настоящее время в литературе отсутствует единое мнение о потенциальной опасности НГ при поступлении в организм. Так, E. Murphy и соавт. [23] установили, что 4 вида филлосиликатов (монтмориллонит, природный бентонит, каолинит, цеолит) вызывали гибель клеток эндотелия человека в концентрациях от 0,01 до 0,1 мг/мл. P. Li и соавт. [24] выявили цитотоксичность монтмориллонитовой НГ для клеток яичника хомяка в концентрации 1 мг/мл. М. Baek и соавт. [25] получили аналогичные результаты на клетках кишечного эпителия. Нанопластинки глины были цитотоксичными для трансформированных клеток легочного эпителия A549 в исследовании N. Verma и соавт. [26]. Нанотрубки галлуазита вызывали гибель клеток HeLa и MCF-7 в концентрации свыше 0,075 мг/мл [9]. В результате "активации" бентонита путем его обработки серной кислотой наблюдалось повышение цитотоксичности для В-лимфобластов человека [27, 28]. Нанодиски глины диаметром менее 50 нм (лапонит) были токсичными для линии эмбриональных клеток почки человека HEK и трансформированной клеточной линии SiHa [29]. С другой стороны, имеются данные об отсутствии у нативного и органически модифицированного монтмориллонита цито- и генотоксичности in vitro [30].

В большинстве исследований НГ in vivo они не вызывали общетоксических и гистопатологических изменений как при однократном (в остром опыте) [31, 32], так и при многократном пероральном введении в экспериментах продолжительностью до 196 сут [33-35] на грызунах. М. Baek и соавт. [25] оценили LD50 немодифицированного монтмориллонита для мышей величиной более 1000 мг на 1 кг массы тела ввиду отсутствия возможности тестирования дозы 2000 мг на 1 кг массы тела из-за высокой плотности раствора. M. Wiles и соавт. [36] сообщали об отсутствии токсичности или очень низкой токсичности немодифицированной НГ для беременных самок крыс Спрег-Доули, причем также не была выявлена и эмбриотоксичность. Однако ранее в работе Patterson и Staszak (цит. по [10]) были выявлены эффекты репродуктивной токсичности, состоящие в анемии у матерей и снижении массы тела новорожденного потомства после экспонирования каолином в количестве 20% по массе корма. D. Kibanova и соавт. [12] сообщили о способности некоторых глин повышать содержание маркеров окислительного стресса в супернатантах мозга. S. Maisanaba и соавт. [35], однако, не подтвердили повышение уровня липоперекисей, изменения активности супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы в печени и почках крыс, экспонированных в течение 40 сут органомодифицированным монтмориллонитом, хотя активность каталазы, содержание ее белка и экспрессия гена в почках увеличивались. EFSA [13] приводит данные о том, что у крыс, получавших бентонит в течение 15 сут, происходят хромосомные аберрации, в то время как A. Sharma и соавт. [37] не наблюдали разрывов цепей ДНК в толстой кишке, печени и почках крыс Вистар, получавших через зонд органически модифицированную НГ двукратно в дозе 250-1000 мг на 1 кг массы тела.

В проведенном нами исследовании также не было выявлено достоверных неблагоприятных воздействий НГ на антиоксидантный статус организма крыс по показателям статуса селена, содержания тканевых тиолов печени и активности глутатионпероксидазы эритроцитов. Однако наблюдавшиеся сдвиги в лейкоцитарной формуле и увеличение массы селезенки косвенно свидетельствуют о развитии иммунной реакции, что требует дальнейшей оценки состояния системы иммунитета с помощью более специфических методов, позволяющих определить уровни цитокинов, хемокинов и ростовых факторов в крови животных и степень их продукции культивируемыми клетками селезенки ex vivo. Наиболее правдоподобным объяснением этих эффектов может быть влияние НГ на состав кишечного микробиоценоза, что согласуется с данными литературы о бактерицидном или бактериостатическом действии НГ [38, 39], а также с результатами работы [14].

Заключение

Таким образом, проведенные исследования показали, что образец бентонитовой НГ, производимой в промышленных масштабах и рекомендованной к использованию в качестве технологического вспомогательного средства, может проявлять различные биологические эффекты для крыс при подостром пероральном поступлении, в числе которых признаки угнетения катаболизма белка вместе с увеличением массы тела, развитие иммунной реакции и угнетение роста бифидофлоры. Перечисленные потенциально неблагоприятные эффекты воздействия НГ на организм, с наибольшей степенью вероятности, связаны с угнетающим влиянием наноматериала на развитие симбиотической кишечной микрофлоры. Максимальная недействующая доза НГ при 92-суточном поступлении составляет для изученного набора показателей, по-видимому, менее 1 мг на 1 кг массы тела.

Литература

1. Tayeb A.H., Tajvidi M. Sustainable barrier system via self-assembly of colloidal montmorillonite and cross-linking resins on nanocellulose interfaces // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2019. Vol. 11, N 1. P. 1604-1615. DOI: 10.1021/acsami.8b16659.

2. Разговорова М.П., Селявин А.В., Разговоров П.Б. Применение глин различного состава для выделения примесей растительных масел // Успехи в химии и химической технологии. 2011. № 25. С. 119-121.

3. Abdel-Wahhab M.A., El-Nekeety A.A., Hathout A.S., Sabery B.A., Ibrahim M.I., Gado R.A. et al. Preparation and characterization of organo-modified nano montmorillonite and evaluation of its ability to adsorb aflatoxins, fumonisins and zearalenone from aqueous solution // Nano Sci. Tech. Open Lib. 2015. Vol. 1, N 1. P. 27-34.

4. Abrahams P.W., Davies T.C., Solomon A.O., Trow A.J., Wragg J. Human geophagia, calabash chalk and undongo: mineral element nutritional implications // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 1. Article ID e53304. DOI: 10.1371/journal.pone.005330.

5. Afriyie-Gyawu E., Wang Z., Ankrah N.A., Xu L., Johnson N.M., Tang L. et al. NovaSil clay does not affect the concentrations of vitamins A and E and nutrient minerals in serum samples from Ghanaians at high risk for aflatoxicosis // Food Addit. Contam. Part A. 2008. Vol. 25. P. 872-884. DOI: 10.1080/02652030701854758.

6. Rodrigues L.A., Figueiras A., Veiga F., de Freitas R.M.., Nunes L.C., da Silva Filho E.C. et al. The systems containing clays and clay minerals from modified drug release: a review // Colloids Surf. B Biointerfaces. 2013. Vol. 103. P. 642-651. DOI: 10.1016/ j.colsurfb.2012.10.068.

7. Akbari Alavijeh M., Sarvi M.N., Ramazani Afarani Z. Properties of adsorption of vitamin B12 on nanoclay as a versatile carrier // Food Chem. 2017. Vol. 219. P. 207-214. DOI: 10.1016/j.food-chem.2016.09.140.

8. Jorda- Beneyto M., Ortuno N., Devis A., Aucejo S., Puerto M.,Gutierrez-Praena D. et al. Use of nanoclay platelets in food pack- 19. aging materials: technical and cytotoxity approach // Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo Risk Assess. 2014.Vol. 31, N 3. P. 354-364. DOI: 10.1080/19440049.2013.874045.

9. Vergaro V., Abdullayev E., Lvov Y.M., Zeitoun A., Cingolani R., Rinaldi R. et al. Cytocompatibility and uptake of halloysite clay nanotubes // Biomacromolecules. 2010. Vol. 11, N 3. P. 820-826. DOI: 10.1021/bm9014446.

10. Maisanaba S., Pichardo S., Puerto M., Gutierrez-Praena D., Camean A.M., Jos A. Toxicological evaluation of clay minerals and derived nanocomposites: a review // Environ. Res. 2015. Vol. 138. P. 233-254. DOI: 10.1016/j.envres.2014.12.024.

11. Moosavi M. Bentonite clay as a natural remedy: a brief review // Iran. J. Public Health. 2017. Vol. 46, N 9. P. 1176-1183. PMCID: PMC5632318.

12. Kibanova D., Nieto-Camacho A., Cervini-Silva J. Lipid peroxidation induced by expandable clay minerals // Environ. Sci. Technol. 2009. Vol. 43, N 19. P. 7550-7555. DOI: 10.1021/es9007917.

13. EFSA. European Food Safety Authority. Scientific opinion on the safety and efficacy of a preparation of bentonite- and sepiolite (Toxfin Dry) as feed additive for all species // EFSA J. 2013. Vol. 11, N 4. P. 1-21. DOI: 10.2903/j.efsa.2013.3179.

14. Смирнова В.В., Тананова О.Н., Шумакова А.А., Трушина Э.Н., Авреньева Л.И., Быкова И.Б. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наноструктурированной бентонитовой глины // Гигиена и санитария. 2012. № 3. С. 76-78.

15. Loskutova L.V., Dubrovina N.I., Markel’ A.L. Comparative analysis of the persistence of a conditioned passive avoidance reflex in rats with different forms of inherited hypertension // Neurosci. Behav. Physiol. 2007. Vol. 37, N 6. P. 577-582.

16. Stuart C.A., Twistelton R., Nicholas M.K., Hide D.W. Passage of cow’s milk proteins in breast milk // Clin. Allergy. 1984. Vol. 14, N 6. P. 533-535.

17. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопросы питания. 2011. Т. 80, № 3. С. 25-30.

18. Разыграев А.В. Метод определения глутатионперокси-дазной активности с использованием пероксида водорода и 5,5’-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) // Клиниколабораторный консилиум. 2004. № 4. С. 19-22.

19. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. Vol. 82, N 1. P. 70-77. DOI: 10.1016/0003-9861(59)90090-6.

20. Голубкина Н.А. Флуориметрический метод определения селена // Журнал аналитической химии. 1995. Т. 50, № 8. С. 492-497.

21. Botros M., Sikaris K.A. The de Ritis ratio: the test of time // Clin. Biochem. Rev. 2013. Vol. 34, N 3. P. 117-130.

22. Рослый И.М. Биохимические показатели в медицине и биологии. Москва : МИА, 2015. 616 с.

23. Murphy E.J., Roberts E., Horrocks L.A. Aluminum silicate toxicity in cell cultures // Neuroscience. 1993. Vol. 55, N 2. P. 597-605.

24. Li P.R., Wei J.C., Chiu Y.F., Su H.L. Peng F.C., Lin J.J. Evaluation 32. on cytotoxicity and genotoxicity of the exfoliated silicate nanoclay // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2010. Vol. 2. P. 1608-1613. DOI: 10.1021/am100П62.

25. Baek M., Lee J.-A., Choi S.-J. Toxicological effects of a cationic clay, montmorillonite in vitro and in vivo // Mol. Cell. Toxicol. 2012. Vol. 8, N 1. P. 95-101. DOI: 10.1007/s13273-012-0012-xro.

26. Verma N.K., Moore E., Blau W., Volkov Y., Babu P.R. Cytotox- 34. icity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis // J. Nanopart. Res. 2012. Vol. 14, N 9. P. 1137-1148. DOI: 10.1007/ s11051-012-1137-5.

27. Zhang M., Li X., Lu Y., Fang X., Chen Q., Xing M., He J. Studying the genotoxic effects induced by two kinds of bentonite particles on human B lymphoblast cells in vitro // Mutat. Res. 2011. Vol. 720. P. 62-66. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2010.12.009.

28. Zhang M., Lu Y., Li X., Chen Q., Lu L., Xing M. et al. Studying the cytotoxicity and oxidative stress induced by two kinds of bentonite particles on human B lymphoblast cells in vitro // Chem. Biol. Interact. 2010. Vol. 183, N 3. P. 390-396. DOI: 10.1016/ j.cbi.2009.11.023.

29. Rawat K., Agarwal S., Tyagi A., Verma A.K., Bohidar H.B. Aspect ratio dependent cytotoxicity and antimicrobial properties of nanoclay // Appl. Biochem. Biotechnol. 2014. Vol. 174, N 3. P. 936-944. DOI: 10.1007/s12010-014-0983-2.

30. Sharma A.K., Schmidt B., Frandsen H., Jacobsen N.R., Larsen E.H., Binderup M.L. Genotoxicity of unmodified and organo-modified montmorillonite // Mutat. Res. 2010. Vol. 700, N 1-2. P. 18-25.DOI: 10.1016/j.mrgentox.2010.04.021.

31. Lee Y.H., Kuo T.F., Chen B.Y., Feng Y.K., Wen Y.R., Lin W.C. et al. Toxicity assessment of montmorillonite as a drug carrier for pharmaceutical applications: yeast and rats model // Biomed. Eng. Appl. Basis Commun. 2005. Vol. 17. P. 72-78. DOI: 10.4015/ S1016237205000111.

32. Mascolo N., Summa V., Tateo F. In vivo experimental data on the mobility of hazardous chemical elements from clays // Appl. Clay Sci. 2004. Vol. 25, N 1-2. P. 23-28. DOI: 10.1016/ j.clay.2003.07.001.

33. Afriyie-Gyawu E., Mackie J., Dash B., Wiles M., Taylor J., Hueb-ner H. et al. Chronic toxicological evaluation of dietary NovaSil clay in Sprague-Dawley rats // Food Addit. Contam. 2005. Vol. 22, N 3. P. 259-269. DOI: 10.1080/02652030500110758.

34. Maisanaba S., Gutierrez-Praena D., Puerto M., Moyano R., Blanco A., Jorda M. et al. Effects of the subchronic exposure to organomodified clay for food packaging applications on Wistar rats // Appl. Clay Sci. 2014. Vol. 95. P. 37-40. DOI: 10.1016/j.clay.2014.04.006.

35. Maisanaba S., Puerto M., Gutierrez-Praena D., Llana-Ruiz-Cabello M., Pichardo S., Mate A. et al. In vivo evaluation of activities and expression of antioxidant enzymes in Wistar rats exposed for 90 days to a modified clay // J. Toxicol. Environ. Health A. 2014. Vol. 77, N 8. P. 456-466. DOI: 10.1080/15287394.2013.876696.

36. Wiles M.W., Huebner H.J., Afriyie-Gyawu E., Taylor R.J., Bratton G.R., Phillips T.D. Toxicological evaluation and metal bioavailability in pregnant rats following exposure to clay minerals in the diet // J. Toxicol. Environ. Health A. 2004. Vol. 67, N 11. P. 863-874. DOI: 10.1080/15287390490425777.

37. Sharma A.K., Mortensen A., Schmidt B., Frandsen H., Hadrup N., Larsen E.H. et al. In vivo study of genotoxic and inflammatory effects of the organo-modified montmorillonite Cloisite 30B // Mutat. Res. 2014. Vol. 770. P. 66-71. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2014.04.023.

38. Williams L.B., Metge D.W., Eberl D.D., Harvey R.W., Turner A.G., Prapaipong P. et al. What makes a natural clay antibacterial? // Environ. Sci. Technol. 2011. Vol. 45, N 8. P. 3768-3773. DOI: 10.1021/ es1040688.

39. Williams L.B., Haydel S.E. Evaluation of the medicinal use of clay minerals as antibacterial agents // Int. Geol. Rev. 2010. Vol. 52, N 7-8. P. 745-770. DOI: 10.1080/00206811003679737.


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»