Определение методом высокоэффективной хроматографии стероидных сапонинов в биологически активных добавках к пище, содержащих экстракт якорцев стелющихся

РезюмеСтероидные сапонины обусловливают биологическую активность якорцев стелющихся (ЯС) и могут быть использованы для оценки качества сырья и продуктов переработки из них. С этой целью была разработана методика качественного и количественного определения стероидных сапонинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим и масс-селективным детектированием; подобраны оптимальные условия пробоподготовки (экстракция 70% метанолом при обработке ультразвуком и нагревании), а также изучен состав стероидных сапонинов ЯС (были обнаружены протодиосцин, трибулосапонин В, метилпротодиосцин, террестрозин Н, прототрибестин, грациллин и др.).

Ключевые слова:якорцы стелющиеся, стероидные сапонины, протодиосцин, биологически активные добавки к пище, высокоэффективная жидкостная хроматография

Одна из наиболее интересных групп биологически активных веществ - стероидные сапонины, что обусловлено широким спектром их активности. В частности, стероидные сапонины якорцев стелющихся (ЯС) обладают гиполипидемической [1-3], антиоксидантной [4], фунгицидной [2, 5-7] и антимикробной активностью [2, 7, 8].

Основными источниками стероидных сапонинов являются растения семейств диоскорейных, амариллисовых, бобовых, лютиковых, норичниковых и др. Среди указанных выше растений ЯС - одни из самых малоизученных. Однако число исследовательских работ, посвященных стероидным сапонинам ЯС, за 2000-2010 гг. возросло в 10 раз (рис. 1). С 2004 г. на рынке появляются биологически активные добавки к пище (БАД), изготовленные на основе экстракта травы ЯС. Согласно данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, количество этих добавок, содержащих ЯС и прошедших государственную регистрацию, за 2004-2009 гг. увеличилось в несколько раз (рис. 2). К настоящему времени имеется около 60 БАД, содержащих в своем составе экстракт травы ЯС (например, БАД "Триболимп", "Мен Суппорт", "Тонгкат Али Плюс", "Апполон" и др.).

Резкое увеличение номенклатуры БАД, содержащих экстракт ЯС, требует разработки методов оценки качества и безопасности таких продуктов. Однако несмотря на предпринимаемые в этой области усилия, химический состав стероидных сапонинов изучен недостаточно, что не позволяет проводить необходимые исследования.

Стандартизация препаратов на основе ЯС часто ведется спектрофотометрическими методами. В этом случае определение стероидных сапонинов, как и многих других соединений, в которых имеются 1 или 2 несопряженные двойные связи, осуществляется в диапазоне длины волн 205-210 нм, что делает спектрофотометрическое определение недостаточно селективным для стероидных сапонинов [9, 10].

Нашей целью была разработка метода стандартизации как сырья для БАД, так и БАД, содержащих экстракт травы ЯС.

Рис. 1. Изменение числа исследовательских работ, посвященных изучению биологических и физико-химических свойств ЯС

Рис. 2. Увеличение количества зарегистрированных БАД, содержащих экстракт ЯС

Метод и материалы

Для изучения состава стероидных сапонинов в объектах исследования применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим и масс-селективным детектированием.

Была использована следующая хроматографическая система: жидкостной хроматограф "Agilent 1100 Series" (Agilent, США) с дегазатором, насосом, обеспечивающим одновременную подачу 2-х растворителей, устройством для автоматического ввода проб (автосемплером) с термостатом проб (температура образцов в лотке 15 °С), термостатом хроматографических колонок (30 °С), спекторофотометрическим детектором и масс-детектором (ионная ловушка с ионизацией электроспреем). Колонка "Atlantis C18", 4,6-250 мм, 5 мкм (Waters, США). Для приготовления подвижной фазы использовали ацетонитрил марки Ultra Gradient Grade, трифторуксусную кислоту (99%) о.с.ч., воду деионизованную (Milli-Q Academic Millipore, Франция).

Для экстракции стероидных сапонинов применяли метиловый спирт (ч.д.а). Центрифугирование образцов проводили на центрифуге "Eppendorf 5418" (Eppendorf, ФРГ). Ультразвуковую обработку образцов осуществляли в УЗ-ванне ("Сапфир", РФ)

В качестве стандартного вещества использовали протодиосцин компании Chromadex (США). Около 5 мг (точная навеска) протодиосцина помещали в мерную колбу объемом 100 мл, добавляли 30 мл 70% метилового спирта до полного растворения вещества и перемешивали. Доводили объем до метки и повторно перемешивали. Полученный раствор перед исследованием фильтровали через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Стандартный раствор хранили при температуре -18 °С в течение 6 мес.В качестве объектов исследования выступали трава ЯС, ее экстракт, а также БАД "Триболимп".

Подготовка проб

При подготовке БАД "Триболимп" брали содержимое 10 капсул и перемешивали. В колбу для экстракции вместимостью 50 мл отвешивали навеску около 200 мг (с точностью 0,1 мг) и добавляли 20 мл 70% метилового спирта. Дальнейшую подготовку осуществляли, как указано выше.

Подготовка экстракта травы ЯС: в колбу для экстракции вместимостью 50 мл отвешивали навеску около 200 мг (с точностью 0,1 мг) и добавляли 20 мл 70% метилового спирта. Дальнейшую подготовку вели, как указано выше.

Приготовленные пробы анализировали в течение суток. При этом было отмечено, что хранение приготовленных проб в течение 3 дней при температуре 2-8 °С не влияло на результаты анализа.

При проведении исследований были соблюдены определенные условия хроматографирования и детектирования.

Подвижная фаза

С учетом физико-химических свойств стероидных сапонинов и литературных данных для анализа было предложено использовать обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ [9-14]. Для лучшего разделения стероидных сапонинов и компонентов матрикса использовали градиентное элюирование смесью ацетонитрила (А) и деионизованной воды, подкисленной трифторуксусной кислотой до рН=3,0 (Б) по схеме, указанной в табл. 1. Скорость потока составляла 0,9 мл/мин. Регенерация колонки занимала 7 мин. Общее время анализа - 53 мин. Подкисление трифторуксусной кислотой осуществляли для улучшения разделения и достижения оптимальной ионизации на масс-детекторе. Детектирование

Учитывая наличие 1 или 2 несопряженных двойных связей в структуре стероидных сапонинов, для детектирования оптимальной длиной волны является 205 нм. Параметры масс-детектирования: режим сканирования ионов - позитивный, диапазон масс сканируемых ионов - от 400 до 1500 м/з; давление небулайзера - 70 пси; скорость газа-осушителя - 12 л/мин; его температура - 350 °С.

Протодиосцин на хроматограмме идентифицировали, сравнивая время удерживания протодиосцина и стандарта. Подтверждение протодиосцина проводили по основному иону 1031 ([М+Н-Н2О]+) и характерной его фрагментации на дочерние ионы.

Результаты и обсуждение

На рис. 3 представлена хроматограмма экстракта якорцев, полученная на спектрофотометрическом детекторе. Поскольку стероидные сапонины ЯС в основном отличаются углеводными остатками и радикалами, их хроматографическое поведение сходно. Время удерживания основных стероидных сапонинов варьировало от 29 до 34 мин. Преобладающим компонентом среди стероидных сапонинов во всех анализируемых образцах является протодиосцин. Его время удерживания составило 31,2 мин. Чувствительность метода - 50 нг для спектрофотометрического детектирования и 1 нг для масс-спектроскопического детектирования. Предел количественного определения составил 1-200 г/кг (для спектрофотометрического детектирования).

Использование масс-спектроскопического детектора позволяет существенно повысить селективность и чувствительность метода, что демонстрирует представленная на рис. 4 хроматограмма экстракта якорцев, полученная на масс-детекторе (общий ионный ток). При масс-детектировании происходит дробление основного иона протодиосцина 1031 ([М+Н-Н2О]+) на дочерние ионы, молекулярные массы которых (м/з) представлены на массспектре протодиосцина (рис. 5). Предполагаемая схема фрагментации протодиосцина представлена на рис. 6.

В результате последовательной потери воды, 1-й молекулы глюкозы, 2-х молекул рамнозы, 2-й молекулы глюкозы образуется набор характерных ионов, расшифровка которых дана в табл. 2.

Таблица 1. Порядок градиентного элюирования стероидных сапонинов

Рис. 3. Хроматограмма экстракта ЯС, полученная на спектрофотометрическом детекторе

Рис. 4. Хроматограмма экстракта ЯС, полученная на масс-детекторе (общий ионный ток)

Рис. 5. Масс-спектр протодиосцина

Рис. 6. Предполагаемая схема фрагментации протодиосцина

П р и м е ч а н и е. 415, 739 - места разрыва связи при масс-детектировании, с указанием молекулярной массы получившегося остатка молекулы протодиосцина. Обозначения других цифр на рисунке аналогичны обозначению 415 и 739; 1031 - масса остатка сапонина; β-D-глк - молекула β-D-глюкозы; α-L-рамн - молекула α-L-рамнозы.

Таблица 2. Расшифровка ионов протодиосцина

В результате проведенных исследований обнаружено, что в состав стероидных сапонинов ЯС входят протодиосцин, трибулосапонин В, метилпротодиосцин, террестрозин Н, прототрибестин, грациллин и др. (см. табл. 2). Причем содержание стероидных сапонинов в пересчете на протодиосцин находится в траве якорцев в пределах 0,62%, а в экстракте - 16,2%.

Таким образом, применяемые методы стандартизации препаратов, содержащих экстракт ЯС, недостаточно селективны, что не позволяет эффективно оценивать содержание стероидных сапонинов. Для стандартизации указанных выше продуктов более подходят разделяющие методы, например, ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием.

Нами были разработаны оптимальные условия хроматографического разделения стероидных сапонинов ЯС методом ВЭЖХ, а также их качественного и количественного определения, подобраны оптимальные условия подготовки объектов исследования, заключающиеся в извлечении стероидных сапонинов 70% метиловым спиртом при обработке УЗ и нагревании.

С помощью разработанной методики установлено, что большинство стероидных сапонинов, обнаруженных в ЯС, найдены и в продуктах, произведенных на их основе (экстракты, БАД "Триболимп"). Таким образом, использование метода ВЭЖХ со спектрофотометрическим и масс-селективным детектированием позволяет с высокой достоверностью оценить состав стероидных сапонинов, выделенных из ЯС.

Таблица 3. Стероидные сапонины, обнаруженные в БАД "Триболимп"

Литература

1. Bedir E., Khan A.I. // J. Nat. Prod. - 2000. - Vol. 63. - P. 16 9 9 -17 0 1.

2. Kostova I., Dinchev D. // Phytochem. Rev. - 2005. - Vol. 4. - P. 111-137.

3. Tuncer M.A., Yaymaci B., Sati L. et al. // Acta Histohem. - 2009. - Vol. 111. - P. 488-500.

4. Pandey P., Shankar B.S., Sainis K.B. // Pharm. Biol. - 2007. - Vol. 45, N 8. - P. 619-625.

5. Conrad J., Dinchev D., Klaiber I. et al. // Fitoterapia. - 2004. - Vol. 75. - P. 117-122.

6. Deeepak M., Dipankar G., Prashanth D. et al. // Phy tomedicine. - 2002. - Vol. 9. - P. 753-756.

7. Al-Ayati F.A., Al-Mola H.F. // J. Zhejiang Univ. Sci. B. - 2008. - Vol. 2, N 9. - P. 154-159.

8. Hussain A.A., Mohammed A.A., Ibrahim H.H., Abbas A.H. // Engineering Technol. - 2009. - Vol. 57. - P. 433-435.

9. Ganzera M., Bedir E., Khan I.A. // J. Pharm. Sci. - 2001. - Vol. 90, N 11. - P. 1752-1758.

10. Oleszek W.A. // J. Cromatogr. A. - 2002. - Vol. 967. - P. 147-16 2 .

11. Combarieu E. De., Fuzzati N., Lovati M. et al. // Fitoterapia. - 2003. - Vol. 74. - P. 583-591.

12. Dinchev D., Janda B., Evstatieva L. et al. // Phytochemistry. - 2008. - Vol. 69. - P. 176-186.

13. Kite G.C., Porter E.A., Simmonds M.S.J. // J. Cromatogr. A. - 2007. - Vol. 1148. - P. 177-183.

14. Mulinacci N., Vignolini P., Marca G. la. // Chromatographia. - 2003. - Vol. 57, N 9/10. - P. 581-592.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

SCImago Journal & Country Rank
Scopus CiteScore
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Тутельян Виктор Александрович
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, научный руководитель ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»

Журналы «ГЭОТАР-Медиа»