Содержание эссенциальных и токсичных микроэлементов в органах мышей различных линий, получавших высокоуглеводный высокожировой рацион с добавлением кверцетина

Резюме

Известно, что кверцетин (Q) является мощным хелатирующим агентом в отношении ионов металлов. Благодаря этому свойству Q при поступлении в организм способен активно вмешиваться в микроэлементный гомеостаз. Оценка возможного значения этих эффектов для диетического применения Q при ожирении затруднена тем обстоятельством, что у больных ожирением наблюдаются обусловленные патогенезом заболевания многочисленные изменения в минеральном обмене и микроэлементном гомеостазе. Таким образом, представляет значительный интерес выявление системных влияний биологически активных веществ, включая Q, на показатели минерального обмена на биологических in vivo моделях (в связи с ограниченным выбором биосубстратов при клинических наблюдениях - плазма крови, моча, волосы).

Цель - изучение возможных воздействий Q на уровни эссенциальных, неэссенциальных и токсичных элементов у мышей трех линий: db/db с нокаутом гена рецептора лептина, склонных к спонтанному развитию ожирения, инбредной линии C57BI/6J, относительно резистентных к развитию алиментарного ожирения, и сложного гибрида II поколения DBCB, генетически более склонных к развитию ожирения и жирового гепатоза при потреблении рационов с избыточной квотой жира и моно - и дисахаридов.

Материал и методы. Содержание 16 химических элементов (Fe, Mg, Cu, Mn, Co, Se, Zn, Cr, Al, Cd, As, Pb, Ni, Ag, V, Cs) определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой в печени, почках, головном мозге генетически склонных к ожирению мышей линии db/db (возраст 8-10 нед), получавших в течение 47 сут стандартный полусинтетический рацион (СПР) и Q в дозах 25 и 100 мг на 1 кг массы тела, мышей линии C57B/6J, получавших СПР или высокожировой высокоуглеводный рацион (ВУВЖР: 30% жиров и 20% раствор фруктозы вместо воды) и добавку к нему Q в тех же дозах, мышей тетрагибридов DBCB, получавших в течение 63 сут СПР, ВУВЖР и ВУВЖР с добавлением Q (25 мг на 1 кг массы тела). Соединения Fe, Zn, Cu, Mn, Mg, Cr, Ni, Se и V входили в состав солевой смеси в форме неорганических солей или оксидов в количествах, близких к физиологической потребности; Al, Cd, As, Pb, Ag, Cs, Co присутствовали в рационах в фоновых количествах.

Результаты и обсуждение. У db/db мышей отмечалось в сравнении с C57B/6J пониженное содержание Pb в печени и повышенное в почках и головном мозге, пониженное - Co в почках, повышенное - Cs и As в головном мозге, что не могло быть объяснено различиями в потреблении этих элементов с кормом. Потребление Q снижало у мышей db/db содержание в печени Mn, Cs, V, Ni, As, повышало уровень Cu и не оказывало значительных воздействий на уровень микроэлементов в печени у животных C57BI/6J. В почках C57BI/6J, получавших Q, возрастало содержание As и Al. В головном мозге мышей db/db добавка Q вызывала снижение содержания As, Pb, Cs и Se. У тетрагибридов DBCB Q повышал уровень Pb в печени и головном мозге и снижал в почках; повышал уровень V в печени и головном мозге; снижал содержание As в почках и повышал в печени. Отмечались множественные корреляции между содержанием в органах элементов в различных валентных формах, а также между содержанием микроэлементов и биохимическими индикаторами интенсивности катаболических и анаболических процессов.

Заключение. Кверцетин оказывает воздействия на гомеостаз микроэлементов, зависящие как от генотипа животных, так и от рациона и не имеющие однозначной физиологической значимости. Рекомендуется включать показатели статуса эссенциальных и токсичных микроэлементов в протоколы доклинических испытаний эффективности и безопасности минорных биологически активных веществ пищи.

Ключевые слова:мыши, ожирение, эссенциальные микроэлементы, токсичные элементы, масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой, кверцетин

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 17-16-01043).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликтов интересов.

Благодарность. Авторы благодарят кандидата медицинских наук ХС. Сото за проведение биохимических анализов плазмы крови.

Для цитирования: Шумакова А.А., Шипелин В.А., Апрятин С.А., Гмошинский И.В. Содержание эссенциальных и токсичных микроэлементов в органах мышей различных линий, получавших высокоуглеводный высокожировой рацион с добавлением кверцетина // Вопросы питания. 2020. Т. 89, № 2. С. 28-45. DOI: 10.24411/0042-8833-10014

Биологически активные вещества (БАВ) полифенольной природы, содержащиеся в растительной пищевой продукции, рассматриваются как перспективные вспомогательные средства в диетотерапии алиментарного ожирения и родственных состояний -метаболического синдрома, сахарного диабета 2 типа, неалкогольного стеатогепатита [1]. В частности, кверцетин (Q; 3,3',4',5,7-пентагидроксифлавон), один из основных флавоноидов красного лука, яблок, многих ягод, цитрусовых, чая и красного вина, при потреблении в дозах, характерных для его содержания в пищевых продуктах, позволяет повышать эффективность стандартной редуцирующей диетотерапии, облегчает метаболические последствия ожирения [2-4]. Механизмы биологических эффектов Q определяются его антиоксидантными свойствами [5], а также способностью модулировать экспрессию ряда критически важных генов энергетического обмена [6]. Вместе с тем Q, как и ряд других полифенольных соединений, является мощным хелатирующим агентом в отношении ионов металлов, некоторые из которых относятся к числу эссенциальных (Fe, Cu, Mn, Zn, Cr), условно-эссенциальных (Ag, V и др.) и токсичных (Pb, Cd, Al и др.) микроэлементов [7]. Благодаря этому свойству Q при поступлении в организм способен влиять на микроэлементный гомеостаз [8]. Оценка возможного значения этих эффектов применения Q при ожирении затруднена тем обстоятельством, что у больных ожирением наблюдаются обусловленные патогенезом заболевания многочисленные изменения в минеральном обмене [9-13]. Поскольку оценка микроэлементного статуса больных в клинических наблюдениях ограничена выбором доступных для исследования биосубстратов (плазма крови, моча, волосы), представляет значительный интерес выявление системных влияний БАВ, включая Q, на показатели минерального обмена на биологических in vivo моделях.

В связи с этим целью настоящей работы было изучение возможных воздействий Q на уровни эссенциальных, неэссенциальных и токсичных элементов у мышей трех линий: db/db с нокаутом гена рецептора лептина, склонных к спонтанному развитию ожирения, инбредной линии C57BI/6J, относительно резистентных к развитию алиментарного ожирения, и сложного гибрида II поколения DBCB, генетически более склонных к развитию ожирения и жирового гепатоза при потреблении рационов с избыточной квотой жира и простых углеводов.

Материал и методы

Дизайн биологического эксперимента. Исследования проводили на 24 самцах мышей линии db/db (возраст 8-10 нед, исходная масса тела 40,2±3,2 г), полученных из питомника ИЦиГ СО РАН (РФ), 24 самцах мышей инбредной линии C57Bl/6J того же возраста (исходная масса тела 21,1 ±0,2 г), полученных из питомника Филиала "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России и 18 мышах-самцах сложного гибрида II поколения DBCB того же возраста, самостоятельно выведенных путем скрещивания 4 различных инбредных линий мышей (DBA/2J, BALB/c, CBA/Iac и C57BIack/6J), согласно [14]. Работу с животными выполняли в соответствии с приказом Минздрава России № 199 н от 01.04.2016 "Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики". Дизайн эксперимента был одобрен Комитетом по этике ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (протокол № 4 от 20.04.2017).

Животные были разделены на 8 групп: 1, 2, 3-я - для db/db по 8 особей; 4, 5, 6, 7-я - для C57BI/6J и 8, 9, 10-я -для DBCB (по 6 особей). В течение 47 дней мыши 1, 4 и 8-й групп получали контрольный сбалансированный полусинтетический рацион для грызунов по AIN93M [15], 2-й и 3-й групп - такой же рацион с добавлением Q из расчета 25 и 100 мг на 1 кг массы тела соответственно, 5-й и 9-й групп - высокожировой (30% жиров) рацион и 20% раствор фруктозы вместо воды (ВУВЖР), 6-й и 10-й групп - ВУВЖР и Q в дозе 25 мг на 1 кг массы тела, 7-й группы - ВУВЖР и Q в дозе 100 мг на 1 кг массы тела. Воду для питья животных и приготовления рационов получали в установке обратного осмоса Milli-RO (Waters, США).

Минеральные вещества в состав всех рационов вносили в виде солевой смеси [15], состав которой представлен в табл. 1. При приготовлении солевой смеси применяли реактивы, имеющие квалификацию чистоты х.ч. или ос.ч. Рационы, воду и раствор фруктозы предоставляли животным в режиме неограниченного свободного доступа. Мышей содержали по 1 (C57Bl/6J) или 2 (db/db и DBCB) особи в клетках из поликарбоната при 12/12-часовом режиме освещения и температуре воздуха 22±1 °С. Ежедневно фиксировали количество съеденного корма и выпитых жидкостей и рассчитывали удельное энергопотребление и дозу Q, при необходимости корректируя его удельное содержание в составе корма. Массу тела определяли еженедельно на электронных весах с точностью ±0,1 г. Общее время кормления животных экспериментальными рационами составило 47 сут для групп с 1-й по 7-ю; 63 сут для групп с 8-й по 10-ю.

Таблица 1. Состав солевой смеси, применяемой при приготовлении экспериментальных рационов1

Table 1. The composition of the salt mixture used in experimental rations1

П р и м е ч а н и е. 1 - содержание солевой смеси - 3,5 г/100 г массы сухого корма.

N o t e. 1 - the content of the salt mixture is 3.5 g/100 g of dry feed mass.

По окончании кормления мышей выводили из эксперимента путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией. Кровь собирали в пробирки с 1,0% раствором гепарина в 0,15 М NaCI (1:10 по объему), плазму отделяли центрифугированием и проводили исследование биохимических показателей [содержание глюкозы, триглицеридов, холестерина общего и в составе липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), общего белка, альбуминов, глобулинов, билирубина, кальция, фосфора, активностей аланин- (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ), липазы] на биохимическом анализаторе KoneIab 20i (Thermo Fisher Scientific, Финляндия). Органы (печень, почки, головной мозг) извлекали стерильными хирургическими инструментами из нержавеющей стали, взвешивали с точностью ±0,01 г и хранили до исследования при температуре -80 °C.

Анализ микроэлементного состава. Содержание 16 химических элементов, включая эссенциальные (Fe, Mg, Cu, Mn, Co, Se, Zn, Cr), токсичные (AI, Cd, As, Pb, Ni) и элементы с недостаточно установленной функцией (Ag, V, Cs) в органах (печень, почки, головной мозг), определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе серии 7700х (AgiIent TechnoIogies, Япония). Минерализацию биологических образцов проводили концентрированной азотной кислотой и концентрированной перекисью водорода в соотношении 2:0,4 в автоматизированной микроволновой системе пробоподготовки TOPwave (Analytic Jena, Германия). Общее число проанализированных образцов печени, почек и головного мозга составило 168 проб. Содержание минеральных веществ выражали в мг на 1 кг ткани (влажной массы).

Статистическая обработка результатов. В целях повышения стабильности и сходимости результата предварительно проводили исключение грубых погрешностей (выпадающих результатов измерений) согласно ГОСТ Р 8.736-2011. Число исключаемых значений составляло не более 1 в каждой группе образцов. После этого проводили расчет выборочного среднего, среднеквадратичного отклонения и стандартной ошибки. Проверку гипотезы об однородности распределения показателей сравниваемых групп осуществляли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) по факторам линии животных, добавки Q и их комбинаций. Гипотезу о несовпадении функций распределения данных в группах проверяли с использованием критерия Манна-Уитни. Взаимосвязь исследуемых показателей оценивали с помощью ранговых коэффициентов корреляции Спирмена. Расчеты выполняли в программе SPSS 20.0.

Результаты

На протяжении эксперимента отмечалась гибель 3 из 8 мышей db/db во 2-й и 5 из 8 в 3-й группе, получавших Q в дозах 25 и 100 мг на 1 кг массы тела. При вскрытии павших животных отмечена острая циркуляторная дисфункция легких и миокарда. Все животные остальных опытных групп выжили, имели нормальный внешний вид и систематически прибавляли в массе тела. Результаты определения удельного (в расчете на 1 кг массы тела) потребления плотной части рациона, являющейся источником всех эссенциальных макро- и микроэлементов, представлены на рис. 1. Как следует из этих данных, для мышей db/db 2-й и 3-й групп, получавших Q, на протяжении большей части эксперимента была характерна незначительная тенденция к снижению количества поедаемого корма по сравнению с контролем, не выходящая за пределы погрешности определения этого показателя. У мышей C57Bl/6J и тетрагибридов DBCB добавка фруктозы к рациону (ВУВЖР) приводила к снижению количества потребляемого корма. Добавление к корму Q, напротив, практически не влияло на этот показатель на протяжении большей части эксперимента (начиная с 20-го дня и далее). Удельное потребление корма мышами db/db 1-й группы в последнюю неделю эксперимента на 50-75% превосходило соответствующий показатель у мышей C57BI/6J 4-й группы, получавших такой же рацион.

Рис. 1. Удельное потребление рациона (без учета фруктозы), г на 1 кг массы тела у мышей db/db (А), C57Bl/6J (Б) и DBCB (В) в зависимости от состава рациона, добавления кверцетина и времени эксперимента

ВУВЖР - высокоуглеводный высокожировой рацион.

Fig. 1. Specific dietary intake (excluding fructose), g/kg body weight. in mice db/db (A), C57Bl/6J (B) and DBCB (C) depending on the composition of the diet, the addition of quercetin and the time of the experiment

HFCD - high fat high carbohydrate diet.

На рис. 2А представлен микроэлементный "портрет" ткани печени мышей db/db контрольной группы в сравнении с мышами C57BI/6J, получавшими контрольный рацион. Как следует из представленных данных, у мышей db/db, несмотря на большее удельное потребление ими корма, содержание в печени Pb, Fe, Mg, Zn было статистически значимо снижено в сравнении с мышами C57BI/6J (ANOVA p<0,05 по фактору "модель"). Однако, за исключением Pb, амплитуда этих изменений не превышала погрешности метода ICP-MS (20%). Уровень As, Co, Cs и V в печени мышей db/db, напротив, был повышен, что может быть связано с проявляемой ими гиперфагией.

Рис. 2. (Начало) Содержание микроэлементов в печени мышей db/db и C57Bl/6J. Сравнение "микроэлементных портретов" ткани (лепестковые диаграммы) для мышей db/db и C57Bl/6J, получающих контрольный рацион (А), мышей db/db, получающих контрольный рацион и различные дозы кверцетина (Б), мышей C57Bl/6J, получающих высокоуглеводный высокожировой рацион и различные дозы кверцетина (В). Среднее (M±m) содержание в ткани печени мышей опытных групп Mn (Г)

* - статистически значимое различие (p<0,05) с группой, не получающей кверцетин; горизонтальные скобки - распределение показателя в группах неоднородно по факторам генотип/модель (М), кверцетин (Q) и их комбинации (M×Q) для охватываемого диапазона, p<0,05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA.

Fig. 2. (Part 1) The trace element content in the liver of db/db and C57Bl/6J mice. Comparison of "microelement portraits" of tissue (petal diagrams) for db/db and C57Bl/6J mice receiving the control diet (A), db/db mice receiving the control diet and various doses of quercetin (B), C57Bl/6J mice receiving a high-fat high-carb diet and various doses of quercetin (C). The average (M±m) content of Mn (D) in the liver tissue of mice of the experimental groups

* - significant difference with the group not receiving quercetin, p<0.05, Mann-Whitney U-test. Horizontal brackets - the distribution of the indicator in groups is heterogeneous by genotype/model factors (M), quercetin (Q) and their combinations (M×Q) for the covered range, p<0.05, two-way ANOVA analysis of variance.

Анализ влияния Q на показатели микроэлементного статуса печени (рис. 2Б, В) показал, что у мышей db/db потребление этой добавки приводило к статистически значимому снижению содержания в печени Mn (рис. 2Г), Cs (рис. 2Д), V (рис. 2Е), Ni, As и повышению Cu (рис. 2Ж). Средние уровни Pb и Fe возрастали недостоверно. Содержание селена статистически значимо снижалось только при дозе Q 25 мг на 1 кг массы тела. У мышей C57BI/6J, получавших ВУВЖР, амплитуда изменений в уровнях микроэлементов под действием Q во всех случаях не превышала ±20%, что меньше погрешности метода анализа.

Рис. 2. (Окончание) Содержание микроэлементов в печени мышей db/db и C57Bl/6J. Среднее (M±m) содержание в ткани печени мышей опытных групп Cs (Д), V (Е) и Cu (Ж)

* - статистически значимое различие (p<0,05) с группой, не получающей кверцетин; # - с группой, получающей кверцетин в дозе 25 мг на 1 кг массы тела, U-тест Манна-Уитни; горизонтальные скобки - распределение показателя в группах неоднородно по факторам генотип/модель (М), кверцетин (Q) и их комбинации (M×Q) для охватываемого диапазон, p<0,05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA.

Fig. 2. (Part 2) The trace element content in the liver of db/db and C57Bl/6J mice. The average (M±m) content of Cs (E), V (F), and Cu (G) in the liver tissue of mice of the experimental groups

* - significant difference with the group not receiving quercetin; # - with the group receiving quercetin at a dose of 25 mg/kg body weight, p<0.05, Mann-Whitney U-test. Horizontal brackets - the distribution of the indicator in groups is heterogeneous by genotype/model factors (M), quercetin (Q) and their combinations (M×Q) for the covered range, p<0.05, two-way ANOVA analysis of variance.

В почках мышей db/db контрольной группы, по сравнению с мышами C57Bl/6J, получавшими контрольный рацион, отмечалось более чем 5-кратное снижение содержания Co (ANOVA р<0,001 по фактору "модель") и повышение уровня Pb, Ni, Cs и Cr, что согласуется с большим удельным потреблением корма мышами данной линии (рис. 3А). Добавление Q в рацион этих животных вызывало относительно небольшое по амплитуде, но статистически значимое снижение содержания Cr, Co и Ni (при высокой дозе) и Mn (при низкой дозе) (рис. 3Б-Е) без существенных изменений в содержании Al и As. У мышей C57BI/6J, получавших ВУВЖР, влияние Q на микроэлементный профиль почек (рис. 3Ж) характеризовалось возрастанием содержания Al (в большей степени при низкой дозе) (см. рис. 3В) и 4-кратным возрастанием As при высокой дозе (рис. 3Д). Изменения в содержании остальных микроэлементов не превышали нормативную погрешность метода.

Рис. 3. (Начало) Содержание микроэлементов в почках мышей db/db и C57Bl/6J. Сравнение "микроэлементных портретов" ткани (лепестковые диаграммы) для мышей db/db и C57Bl/6J, получающих контрольный рацион (А), мышей db/db, получающих контрольный рацион и различные дозы кверцетина (Б). Среднее (M±m) содержание в ткани почек мышей опытных групп Al (В), Cr (Г)

* - статистически значимое (p<0,05) различие с группой, не получающей кверцетин, согласно U-тесту Манна-Уитни; горизонтальные скобки - распределение показателя в группах неоднородно по факторам генотип/модель (М), кверцетин (Q) и их комбинации (M×Q) для охватываемого диапазона, p<0,05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA.

Fig. 3. (Part 1) The trace element content in the kidneys of db/db and C57Bl/6J mice. Comparison of "microelement portraits" of tissue (petal diagrams) for db/db and C57Bl/6J mice receiving the control diet (A), db/db mice receiving the control diet and various doses of quercetin (B). The average (M±m) content of Al (C), Cr (D) in the kidney tissue of mice of the experimental groups

* - significant difference with the group not receiving quercetin, p<0.05, Mann-Whitney U-test. Horizontal brackets - the distribution of the indicator in groups is heterogeneous by genotype/model (M) and quercetin (Q) factors and their combinations (M×Q) for the covered range, p<0.05, ANOVA two-way analysis of variance.

Рис. 3. (Окончание) Содержание микроэлементов в почках мышей db/db и C57Bl/6J. Среднее (M±m) содержание в ткани почек мышей опытных групп As (Д) и Mn (Е). Сравнение "микроэлементных портретов" ткани (лепестковые диаграммы) для мышей C57Bl/6J, получающих высокоуглеводный высокожировой рацион и различные дозы кверцетина (Ж)

* - статистически значимое (p<0,05) различие с группой, не получающей кверцетина, согласно U-тесту Манна-Уитни; горизонтальные скобки - распределение показателя в группах неоднородно по факторам генотип/модель (М), кверцетин (Q) и их комбинации (M×Q) для охватываемого диапазон, p<0,05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA.

Fig. 3. (Part 2) The trace element content in the kidneys of db/db and C57Bl/6J mice. The average (M±m) content of As (E), and Mn (F) in the kidney tissue of mice of the experimental groups. Comparison of "microelement portraits" of tissue (petal diagrams) for C57Bl/6J mice receiving a high-fat high-carb diet and various doses of quercetin (G)

* - significant difference with the group not receiving quercetin, p<0.05, Mann-Whitney U-test. Horizontal brackets - the distribution of the indicator in groups is heterogeneous by genotype/model (M) and quercetin (Q) factors and their combinations (M×Q) for the covered range, p<0.05, ANOVA two-way analysis of variance.

В головном мозге мышей db/db, по сравнению с мышами C57Bl/6J на контрольном рационе (рис. 4А), наблюдались статистически значимо повышенные уровни целого ряда как токсичных (Pb, As, Cd), так и эссенци-альных (Co, Se, Cu, Zn) микроэлементов, а также Cs (во всех случаях ANOVA p<0,05 по фактору "генотип").

При этом увеличение содержания As, Pb и Cs у db/db было более чем троекратным, что трудно объяснить только несколько большим удельным потреблением корма этими животными. Влияние Q на накопление микроэлементов в мозге мышей db/db (рис. 4Б) проявлялось в снижении содержания As (рис. 4В), Cs (рис. 4Г), Pb (рис. 4Д), а также Se (рис. 4Е), которое, по-видимому, не могло быть объяснено незначительным снижением поедаемости корма у животных, получавших Q.

В отличие от этого, у мышей С57Bl/6J добавка Q (рис. 4З) усиливала накопление Pb (на уровне тенденции), Cr и Al (рис. 4Ж), а влияние на статус остальных элементов было несущественным.

Рис. 4. (Начало) Содержание микроэлементов в головном мозгу мышей db/db и C57Bl/6J. Сравнение "микроэлементных портретов" ткани (лепестковые диаграммы) для мышей db/db и C57Bl/6J, получающих контрольный рацион (А), мышей db/db, получающих контрольный рацион и различные дозы кверцетина (Б). Среднее (M±m) содержание в ткани головного мозга мышей опытных групп As (В), Cs (Г)

* - статистически значимое (p<0,05) различие с группой, не получающей кверцетина, U-тест Манна-Уитни; горизонтальные скобки - распределение показателя в группах неоднородно по факторам генотип/модель (М), кверцетин (Q) и их комбинации (M×Q) для охватываемого диапазона, p<0,05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA.

Fig. 4. (Part 1) The trace element content in the brain of db/db and C57Bl/6J mice. Comparison of "microelement portraits" of tissue (petal diagrams) for db/db and C57Bl/6J mice receiving the control diet (A), db/db mice receiving the control diet and various doses of quercetin (B). The average (M±m) content of As (C), Cs (D) in the brain tissue of mice of the experimental groups

* - significant difference with the group not receiving quercetin, p<0.05, Mann-Whitney U-test. Horizontal brackets - the distribution of the indicator in groups is heterogeneous by genotype/model (M) and quercetin (Q) factors and their combinations (M×Q) for the covered range, p<0.05, ANOVA two-way analysis of variance.

Отдельно следует рассмотреть результаты анализа статуса микроэлементов в эксперименте с мышами тетрагибридами DBCB. В печени (рис. 5А) и почках (рис. 5Б) этих животных, получавших ВУВЖР, содержание большинства изученных элементов находилось ниже уровня контрольной группы, что, по-видимому, объясняется снижением поедаемости плотного компонента рациона, а в мозге (рис. 5В) различия между этими группами по содержанию всех элементов были незначительными (в пределах 20%, т.е. не выше погрешности метода). На этом фоне Q в дозе 25 мг на 1 кг массы тела оказывал ряд воздействий на уровни элементов: повышал содержание Pb в печени и головном мозге (ANOVA p<0,05 по фактору "кверцетин") и снижал в почках (рис. 5Г-Е); повышал уровень V в печени и головном мозге (ANOVA p<0,05 по фактору "кверцетин"); снижал содержание As в почках и повышал в печени.

Рис. 4. (Окончание) Содержание микроэлементов в головном мозге мышей db/db и C57Bl/6J. Среднее (M±m) содержание в ткани головного мозга мышей опытных групп Pb (Д), Se (Е) и Al (Ж). Сравнение "микроэлементных портретов" ткани (лепестковые диаграммы) для мышей C57Bl/6J, получающих высокоуглеводный высокожировой рацион (ВУВЖР) и различные дозы кверцетина (З)

* - статистически значимое (p<0,05) различие с группой, не получающей кверцетина, U-тест Манна-Уитни; горизонтальные скобки - распределение показателя в группах неоднородно по факторам генотип/модель (М) и кверцетин (Q) и их комбинации (M×Q) для охватываемого диапазона, p<0,05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA.

Fig. 4. (Part 2) The trace element content in the brain of db/db and C57Bl/6J mice. The average (M±m) content of Pb (E), Se (F) and Al (G) in the brain tissue of mice of the experimental groups. Comparison of "microelement portraits" of tissue (petal diagrams) for C57Bl/6J mice receiving a high-fat high-carb diet (HFCD) and various doses of quercetin (H)

* - significant difference with the group not receiving quercetin, p<0.05, Mann-Whitney U-test. Horizontal brackets - the distribution of the indicator in groups is heterogeneous by genotype/model (M) and quercetin (Q) factors and their combinations (M×Q) for the covered range, p<0.05, ANOVA two-way analysis of variance.

Результаты расчета корреляций (табл. 2) показали, что для печени и почек мышей были характерны выраженные множественные (уровень значимости α<0,001) положительные взаимосвязи между содержанием элементов, представленных при физиологических условиях двухвалентными катионами (Fe, Mg, Cu, Zn, Cd, Pb, Ni), а также между содержанием элементов в иных валентных формах (As, Al, Se, Cs). Отрицательные корреляции, отражающие антагонизм микроэлементов, отмечались для пар Cd-Se, Mn-Co, Cs-Fe. В головном мозге также отмечались множественные положительные корреляции, причем для таких пар, как Fe-V (r=0,944; α<0,001), Fe-Cd (r=0,942; α<0,001), Fe-Ag (r=0,921; α<0,001) и Fe-Ni (r=0,918; α<0,001), наблюдалась практически линейная зависимость. Анализ связи с биохимическими параметрами позволил установить, что для показателей, характеризующих интенсивность анаболических процессов, включая уровни глюкозы, альбумина, общего белка, глобулинов, общего холестерина, ЛПВП, триглицеридов, характерно наличие положительных корреляций с содержанием в печени и почках As и Co и отрицательных с уровнем Cu, Mn, Fe, Pb и Cd. С другой стороны, отношение де Ритиса (АСТ/АЛТ), характеризующее интенсивность процессов катаболизма, положительно коррелировало с накоплением Cd и Zn и отрицательно с уровнем As, Co и V.

Рис. 5. (Начало) Содержание микроэлементов в органах мышей тетрагибридов DBCB. Сравнение "микроэлементных портретов" (лепестковые диаграммы) ткани печени (А), почек (Б) и головного мозга (В) для животных, получающих контрольный рацион, высокоуглеводный высокожировой рацион и кверцетин. Среднее (M±m) содержание As, Pb и V в печени (Г)

* - различие с группой, получающей контрольный рацион, достоверно; # - различие с группой, получающей высокоуглеводный высокожировой рацион (ВУВЖР), достоверно, p<0,05, U-тест Манна-Уитни; горизонтальные скобки - распределение показателя в группах неоднородно по фактору кверцетин (Q) для охватываемого диапазона, p<0,05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA.

Fig. 5. (Part 1) The content of trace elements in the organs of DBCB tetrahybrid mice. Comparison of "microelement portraits" (petal diagrams) of liver tissue (A), kidneys (B) and brain (C) for animals receiving a control diet, a high-fat high carb diet (HFCD) supplementation of quercetin.

The average (M±m) content of As, Pb and V in the liver (D)

* - significant difference with the group receiving the control diet; # - with the group receiving a HFCD, p<0.05, Mann-Whitney U test. Horizontal brackets - the distribution of the indicator in groups is not uniform for the quercetin factor (Q) for the range covered, p<0.05, ANOVA two-way analysis of variance.

Рис. 5. (Окончание) Содержание микроэлементов в органах мышей тетрагибридов DBCB. Среднее (M±m) содержание As, Pb и V в почках (Д) и головном мозге (Е)

* - различие с группой, получающей контрольный рацион, достоверно; # - различие с группой, получающей высокоуглеводный высокожировой рацион (ВУВЖР), достоверно, p<0,05, U-тест Манна-Уитни; горизонтальные скобки - распределение показателя в группах неоднородно по фактору кверцетин (Q) для охватываемого диапазона, p<0,05, двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA.

Fig. 5. (Part 2) The content of trace elements in the organs of DBCB tetrahybrid mice. The average (M±m) content of As, Pb and V in the kidneys (E) and the brain (F)

* - significant difference with the group receiving the control diet; # - with the group receiving a high-fat high-carb diet (HFCD), p<0.05, Mann-Whitney U-test. Horizontal brackets - the distribution of the indicator in groups is not uniform for the quercetin factor (Q) for the range covered, p<0.05, ANOVA two-way analysis of variance.

Таблица 2. Результаты анализа корреляций между уровнем микроэлементов и биохимическими показателями плазмы крови по всей выборке животных, использованных в экспериментах

Table 2. The results of the analysis of correlations between the level of trace elements, and biochemical parameters of blood plasma throughout the sample of animals used in the experiments

П р и м е ч а н и е. Указаны корреляционные зависимости, достоверные на уровне значимости α<0,001 (положительные, +кор) и α<0,01 (отрицательные, -кор). Прочерк - достоверных зависимостей на данных уровнях значимости не найдено.

N o t e. Correlation dependences are indicated that are significant at level α<0.001 (positive correlation, +cor) and α<0.01 (negative correlation, -cor). Dash - no reliable relationships were found for these significance levels

Обсуждение

Распределение и накопление эссенциальных, неэссенциальных и токсичных минеральных веществ (микроэлементов и макроэлемента Mg) в органах мышей были изучены нами в условиях поступления в организм Fe, Zn, Cu, Mn, Mg, Cr, Ni, Se и V в форме неорганических солей на уровне, близком к физиологической потребности животных в этих элементах [15]. Соединения токсичных металлов (Pb, Cd, As, Al), а также Co, Ag и Cs в состав солевой смеси специально не включали, и эти элементы поступали в организм животных с другими компонентами рациона, в котором присутствовали в фоновых количествах. Небольшие дополнительные количества Co в рационе поступали в форме цианкобаламина (витамин В12). Поскольку такие двухвалентные металлы, как Zn, Cu, Mn, Mg, Ni, были представлены в солевой смеси водонерастворимыми оксидами или карбонатами, а Fe - хелатным комплексом с цитратом, представляется маловероятным протекание процессов комплексообразования указанных элементов с Q в ходе приготовления, хранения и раздачи рационов.

Основным ограничением применяемой экспериментальной модели стало то, что удельное (на единицу массы тела) количество поедаемой плотной части рационов, являющейся главным источником минеральных веществ, было систематически снижено у мышей, получавших раствор фруктозы, по сравнению с получавшими стандартный рацион, и повышено у db/db в сравнении с мышами других линий, что могло приводить к различиям в уровнях потребления ряда элементов (см. рис. 1). Однако несмотря на это у мышей db/db отмечались такие различия с мышами C57Bl/6J в содержании Pb в печени, Co в почках, Pb, Cs и As в головном мозге, которые не могли быть объяснены имевшимися различиями в потреблении этих элементов с кормом, а отражали изменения в минеральном гомеостазе, вызванные ожирением, на наличие которых указывают данные работ [16-20]. Следует отметить, что в перечисленных работах данные изменения были изучены преимущественно на моделях крыс, получавших высокожировой рацион, и при интерпретации имеющихся результатов следует принимать во внимание возможные межвидовые различия.

Как показали результаты проведенных нами экспериментов, Q оказывал неоднозначное действие на накопление микроэлементов в органах мышей. Так, в печени мышей db/db Q приводил к снижению уровней Mn, V и Cs и повышал содержание Cu. В почках этих животных под действием Q отмечалось снижение уровня Mn и Cr, в головном мозге - As, Cs, Se и Pb (на уровне тенденции). На фоне потребления ВУВЖР у мышей C57BI/6J Q в низкой дозе не оказывал таких воздействий, а при дозе 100 мг на 1 кг массы тела отмечалось аномальное повышение уровня As в почках и Al в головном мозге. При единственной изученной у мышей тетрагибридов дозе (25 мг на 1 кг массы тела) Q способствовал снижению содержания As и Pb в почках, тогда как в печени и головном мозге при этом отмечалось возрастание накопления Pb и V. Таким образом, Q обладает способностью влиять на накопление и распределение между периферическими органами и центральной нервной системой ряда элементов, включая проявляющие нейротоксическое действие Pb и Al [21], в условиях их фонового поступления с рационом, однако направленность этих изменений зависит, по-видимому, как от генотипа животных, так и от исходной степени нарушения микроэлементного гомеостаза, вызванного развившимся ожирением (у мышей db/db) и/или потреблением ВУВЖР (у животных двух других линий). По данным ряда исследований, пероральное введение Q экспериментальным животным (главным образом, крысам) способно снижать у них уровень накопления в тканях и токсичность As [22], Pb [5, 23], Cd [24, 25], а также Co [26] и Ni [27]. Однако методология исследований, применявшихся в указанных работах, имела ту особенность, что перечисленные токсичные металлы специально вводили в организм животных с пищей в субтоксических или даже токсических дозах.

Наличие корреляций между накоплением большого числа эссенциальных и токсичных элементов в органах мышей (в особенности в головном мозге) согласуется с данными литературы [17] и косвенно свидетельствует о важной роли в этих процессах как конкуренции минеральных ионов за транспортные системы и сайты связывания, так и их совместного влияния на экспрессию генов [28, 29]. Особого внимания заслуживает отрицательная корреляционная взаимосвязь накопления в печени, почках и головном мозге As, Co и V со значением коэффициента де Ритиса (АСТ/АЛТ), повышение которого является индикатором усиления скорости катаболических реакций [30].

Результаты настоящей работы свидетельствуют, что уровень ультрамикроэлемента Cs в органах мышей подвержен существенным влияниям со стороны Q, поступающего с рационом, а также коррелирует с накоплением значительного числа других микроэлементов, включая такие физиологически значимые, как As, Pb, Al, Ni, Cr, Fe, Se. Ранее нами были выявлены изменения в содержании Cs в почках крыс и мышей при сочетанной недостаточности витаминов группы В [31]. Роль Cs в процессах минерального обмена мало изучена; предполагается наличие у него токсичности из-за способности блокировать транспорт калия вследствие конкуренции за общие трансмембранные переносчики [32]. Более перспективным, однако, представляется рассмотрение Cs в качестве одного из чувствительных маркеров водно-солевого гомеостаза [33].

Заключение

В заключение необходимо отметить, что, как следует из полученных результатов работы, вводимый в состав рационов мышей Q оказывает разнонаправленные воздействия на содержание ряда эссенциальных и токсичных элементов, зависящие от линии животных и применяемого рациона. С одной стороны, выявленное у получающих Q генетически склонных к ожирению мышей db/db снижение содержания As в головном мозге, а у мышей тетрагибридов - As и Pb в почках может свидетельствовать о проявлении данной добавкой детоксицирующего действия. С другой стороны, у не предрасположенных к развитию ожирения мышей C57BI/6J высокая и, возможно, превосходящая адекватный уровень потребления доза Q 100 мг на 1 кг массы тела вызывала увеличение накопления AI в мозге и аномальное повышение содержания As в почках. В связи с этим показатели статуса эссенциальных и токсичных микроэлементов следует рассматривать как заслуживающие включения в протоколы доклинических, а при наличии доступных биосубстратов - волос, мочи, плазмы крови, также и клинических испытаний эффективности и безопасности БАВ и содержащих полифенолы биологически активных добавок к пище.

Литература

1. Тутельян В.А., Киселева Т.Л., Кочеткова А.А., Смирнова Е.А., Киселева М.А., Саркисян В.А. Перспективные источники фитонутриентов для специализированных пищевых продуктов с модифицированным углеводным профилем: опыт традиционной медицины // Вопросы питания. 2016. Т. 84, № 4. С. 46-60. DOI: 10.24411/0042-8833-2016-00050.

2. Kobori M., Masumoto S., Akimoto Y., Oike H. Chronic dietary intake of quercetin alleviates hepatic fat accumulation associated with consumption of a Western-style diet in C57/BL6J mice // Mol. Nutr. Food Res. 2011. Vol. 55. P. 530-540. DOI: 10.1002/mnfr.201000392.

3. Panchal S.K., Poudyal H., Brown L. Quercetin ameliorates cardiovascular, hepatic, and me-tabolic changes in diet-induced metabolic syndrome in rats // J. Nutr. 2012. Vol. 142, N 6. P. 1026-1032. DOI: 10.3945/jn.111.157263.

4. Edwards R.L., Lyon T., Litwin S.E., Rabovsky A., Symons J.D., Jalili T. Quercetin reduces blood pressure in hypertensive subjects // J. Nutr. 2007. Vol. 137. P. 2405-2411. DOI: 10.1093/jn/137.11.2405.

5. Pingili R.B., Challa S.R., Pawar A.K., Toleti V., Kodali T., Koppula S. A systematic review on hepatoprotective activity of quercetin against various drugs and toxic agents: evidence from preclinical studies // Phytother. Res. 2019 Oct 15. DOI: 10.1002/ptr.6503. URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ptr.6503.

6. Castrejón-Tellez V., Rodríguez-Pérez J.M., Pérez-Torres I., Pérez-Hernández N., Cruz-Lagunas A., Guarner-Lans V. et al. The effect of resveratrol and quercetin treatment on PPAR mediated uncoupling protein (UCP-) 1, 2, and 3 expression in visceral white adipose tissue from metabolic syndrome rats // Int. J. Mol. Sci. 2016. Vol. 17, N 7. P. 1069. DOI: 10.3390/ijms17071069.

7. Borowska S., Brzoska M.M., Tomczyk M. Complexation of bioelements and toxic metals by polyphenolic compounds - implications for health // Curr. Drug Targets. 2018. Vol. 19, N 14. P. 1612-1638. DOI: 10.2174/1389450119666180403101555.

8. Flora S.J., Shrivastava R., Mittal M. Chemistry and pharmacological properties of some natural and synthetic antioxidants for heavy metal toxicity // Curr. Med. Chem. 2013. Vol. 20, N 36. P. 4540-4574. DOI: 10.2174/09298673113209990146.

9. Skalny A.V., Tinkov A.A., Bohan T.G., Shabalovskaya M.B., Terekhina O., Leshchinskaia S.B. et al. The impact of maternal overweight on hair essential trace element and mineral content in pregnant women and their children // Biol. Trace Elem. Res. 2019. Vol. 193. P. 64-72. DOI: 10.1007/s12011-019-01693-8.

10. Zohal M., Jam-Ashkezari S., Namiranian N., Moosavi A., Ghadiri-Anari A. Association between selected trace elements and body mass index and waist circumference: a cross sectional study // Diabetes Metab. Syndr. 2019. Vol. 13, N 2. P. 1293-1297. DOI: 10.1016/j.dsx.2019.01.019.

11. Adnan M.T., Amin M.N., Uddin M.G., Hussain M.S., Sarwar M.S., Hossain M.K. et al. Increased concentration of serum MDA, decreased antioxidants and altered trace elements and macro-minerals are linked to obesity among Bangladeshi population // Diabetes Metab. Syndr. 2019. Vol. 13, N 2. P. 933-938. DOI: 10.1016/j.dsx.2018.12.022.

12. Skalnaya M.G., Skalny A.V., Grabeklis A.R., Serebryansky E.P., Demidov V.A., Tinkov A.A. Hair trace elements in overweight and obese adults in association with metabolic parameters // Biol. Trace Elem. Res. 2018. Vol. 186, N 1. P. 12-20. DOI: 10.1007/s12011-018-1282-5.

13. Fan Y., Zhang C., Bu J. Relationship between selected serum metallic elements and obesity in children and adolescent in the U.S. // Nutrients. 2017. Vol. 9, N 2. P. E104. DOI: 10.3390/nu9020104.

14. Apryatin S.A., Mzhel’skaya K.V., Trusov N.V., Balakina A.S., Soto Kh.S., Beketova N.A. et al. Biochemical and morphological parameters of inbred/outbred lines and DBCB tetrahybrid mouse in high-sugar in vivo model of metabolic syndrome // Bull. Exp. Biol. Med. 2018. Vol. 166, N 1. P. 96-101. DOI: 10.1007/s10517-018-4296-2.

15. Reeves P.C. AIN-93 purified diets for the study of trace elements metabolism in rodents // Trace Elements in Laboratory Rodents / ed. R.R. Watson. New York, etc : CRC Press, 2000. ISBN 0-8493-9611-5.

16. Чурин Б.В., Асташов В.В., Трунова В.А., Зверева В.В., Старкова Е.В. Эссенциальные микроэлементы Fе, Cu, Mn, Zn, Se, As в печени и легких при алиментарном ожирении в эксперименте // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2011. № 6. С. 59-63.

17. Churin B.V., Trunova V.A., Sidorina A.V., Zvereva V.V., Astashov V.V., Preobrazhenskaya V.K. et al. Recombination of correlations between bioelements in the liver and lungs during modeling of diet-induced obesity // Bull. Exp. Biol. Med. 2016. Vol. 160, N 3. P. 308-312. DOI: 10.1007/s10517-016-3158-z.

18. Тиньков А.А., Гатиатулина Е.Р., Попова Е.В., Полякова В.С., Скальная А.А., Аглетдинов Э.Ф. и др. Влияние адипогенной диеты в раннем возрасте на содержание микроэлементов в тканях крыс // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2016. Т. 60, № 4. С. 79-85.

19. Trunova V.A., Sidorina A.V., Zvereva V.V., Churin B.V., Starkova E.V., Sorokoletov D.S. Content of bioelements in the lungs and liver in rats with alimentary obesity // J. Trace Elem. Med. Biol. 2016. Vol. 33. P. 95-99. DOI: 10.1016/j.jtemb.2015.08.005.

20. Staniek H., Rhodes N.R., Di Bona K.R., Deng G., Love S.T., Pledger L.A. et al. Comparison of tissue metal concentrations in Zucker lean, Zucker obese, and Zucker diabetic fatty rats and the effects of chromium supplementation on tissue metal concentrations // Biol. Trace Elem. Res. 2013. Vol. 151, N 3. P. 373-383. DOI: 10.1007/s12011-012-9565-8.

21. Huat T.J., Camats-Perna J., Newcombe E.A., Valmas N., Kitazawa M., Medeiros R. Metal toxicity links to Alzheimer’s disease and neuroinflammation // J. Mol. Biol. 2019. Vol. 431, N 9. P. 1843-1868. DOI: 10.1016/j.jmb.2019.01.018.

22. Jahan S., Rehman S., Ullah H., Munawar A., Ain Q.U., Iqbal T. Ameliorative effect of quercetin against arsenic-induced sperm DNA damage and daily sperm production in adult male rats // Drug Chem. Toxicol. 2016. Vol. 39, N 3. P. 290-296. DOI: 10.3109/01480545.2015.1101772.

23. Liu C.M., Zheng G.H., Cheng C., Sun J.M. Quercetin protects mouse brain against lead-induced neurotoxicity // J. Agric. Food Chem. 2013. Vol. 61, N 31. P. 7630-7635. DOI: 10.1021/jf303387d.

24. Halder S., Kar R., Chakraborty S., Bhattacharya S.K., Mediratta P.K., Banerjee B.D. Cadmium level in brain correlates with memory impairment in F1 and F2 generation mice: improvement with quercetin // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2019. Vol. 26, N 10. P. 9632-9639. DOI: 10.1007/s11356-019-04283-2.

25. Badr G.M., Elsawy H., Sedky A., Eid R., Ali A., Abdallah B.M. et al. Protective effects of quercetin supplementation against short-term toxicity of cadmium-induced hematological impairment, hypothyroidism, and testicular disturbances in albino rats // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2019. Vol. 26, N 8. P. 8202-8211. DOI: 10.1007/s11356-019-04276-1.

26. Ajibade T.O., Oyagbemi A.A., Omobowale T.O., Asenuga E.R., Adigun K.O. Quercetin and vitamin C mitigate cobalt chloride-induced hypertension through reduction in oxidative stress and nuclear factor kappa beta (NF-Kb) expression in experimental rat model // Biol. Trace Elem. Res. 2017. Vol. 175, N 2. P. 347-359. DOI: 10.1007/s12011-016-0773-5.

27. Liu C.M., Ma J.Q., Xie W.R., Liu S.S., Feng Z.J., Zheng G.H. et al. Quercetin protects mouse liver against nickel-induced DNA methylation and inflammation associated with the Nrf2/HO-1 and p38/STAT1/NF-κB pathway // Food Chem. Toxicol. 2015. Vol. 82. P. 19-26. DOI: 10.1016/j.fct.2015.05.001.

28. Tinkov A.A., Sinitskii A.I., Popova E.V., Nemereshina O.N., Gatiatulina E.R., Skalnaya M.G. et al. Alteration of local adipose tissue trace element homeostasis as a possible mechanism of obesity-related insulin resistance // Med. Hypotheses. 2015. Vol. 85, N 3. P. 343-347. DOI: 10.1016/j.mehy.2015.06.005.

29. Bjorklund G., Aaseth J., Skalny A.V., Suliburska J., Skalnaya M.G., Nikonorov A.A. et al. Interactions of iron with manganese, zinc, chromium, and selenium as related to prophylaxis and treatment of iron deficiency // J. Trace Elem. Med. Biol. 2017. Vol. 41. P. 41-53. DOI: 10.1016/j.jtemb.2017.02.005.

30. Botros M., Sikaris K.A. The de Ritis ratio: the test of time // Clin. Biochem. Rev. 2013. Vol. 34, N 3. P. 117-130.

31. Apryatin S.A., Shumakova A.A., Vrzhesinskaya O.A., Leonenko S.N., Kodentsova V.M. et al. Alteration of mineral element status of rodents under combined group B vitamin deficiency // Trace Elem. Electrolytes. 2018. Vol. 35, N 4. P. 193-195. DOI: 10.5414/TEX0155405.

32. Melnikov P., Zanoni L.Z. Clinical effects of cesium intake // Biol. Trace. Elem. Res. 2010. Vol. 135, N 1-3. P. 1-9.

33. Leggett R.W., Williams L.R., Melo D.R., Lipsztein J.L. A physiologically based biokinetic model for cesium in the human body // Sci. Total Environ. 2003. Vol. 317, N 1-3. P. 235-255.


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»