Функционирование организма, состояние его органов и тканей, способность адаптироваться к условиям внешней среды, включая резерв возможностей нейтрализовать вредные ксенобиотики, во многом определяются качеством потребляемых пищевых продуктов, важнейшим компонентом которых наряду с белком являются жиры.
Количеством и качеством жиров, поступающих в организм, в большой мере определяется состояние метаболических процессов, в том числе включение химических веществ в клеточные и субклеточные структуры.
Печень занимает центральное место в поддержании биохимического гомеокинеза организма, участвуя в процессах белкового, липидного, углеводного и пигментного метаболизма, а также в процессах детоксикации промышленных и природных токсикантов, попадающих в организм человека [1].
Чужеродные вещества могут оказывать значительное воздействие не только на печень, но и на другие органы (например, на поджелудочную железу), приводящее к формированию их токсического поражения. В связи с этим проблема изучения молекулярных механизмов регуляции функциональной активности печени и ее метаболической адаптации к воздействию токсических агентов остается важным направлением современной экспериментальной и клинической гепатологии [2, 3].
Многофакторность патогенеза поражений печени требует, чтобы и защита осуществлялась на раз- личных уровнях и структурах, что определяет перспективность поиска новых гепатопротекторов.
В современной литературе для профилактики и лечения токсических поражений печени обсуждаются эффекты как широко известных препаратов природного происхождения на основе фосфолипидов (ФЛ) и триацилглицеридов (ТАГ) - "Эссенциале Форте Н", "Фосфоглив", "Эссливер Форте", "Омакор", так и менее известных (льняное масло, пальмовое масло), содержащих в своем составе полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), жирорастворимые витамины и другие соединения, нормализующие метаболические процессы в печени и восстанавливающие целостность мембран гепатоцитов [4-7].
В настоящее время актуальным является не только поиск новых эффективных и безопасных гепатозащитных препаратов, но и сравнительное изучение особенностей и интимных механизмов действия уже известных гепатопротекторов. Однако как известные соединения, широко применяющиеся в настоящее время в медицине, так и менее распространенные на российском рынке препараты изучены не в полной мере. В связи с этим представляется актуальным исследование по уточнению биохимических механизмов, лежащих в основе токсического поражения печени веществами различной химической природы, а также поиск и изучение механизма действия новых, наиболее эффективных гепатопротекторов, с выраженными гиполипидемическими и антиоксидантными свойствами [8, 9].
В сравнительном аспекте был изучен химический состав и свойства растительных масел: подсолнечного, кукурузного, оливкового, льняного, грецкого и черного орехов. Антиоксидантные свойства исследуемых растительных масел сопоставляли по их эффектам с фармпрепаратами "Фосфоглив", "Эссенциале форте Н" и "Эссливер форте", основу которых составляют эссенциальные фосфолипиды, преимущественно фосфатидилхолин. Метаболическую доступность оценивали по способности ТАГ и ФЛ растительных масел и фармпрепаратов гидролизоваться под действием липаз и фосфолипаз. На основе результатов изучения химического состава, интенсивности липолитического гидролиза и антиоксидантных свойств растительных масел и ряда фармпрепаратов были отобраны наиболее перспективные продукты растительного происхождения с потенциальным гепатопротекторным действием (масла льна, черного и грецкого орехов), а также фармпрепарат "Фосфоглив" для изучения влияния исследуемых веществ на состояние метаболических процессов у крыс с моделированием токсического поражения печени (ТПП) [10-12].
Цель исследования - изучение направленности изменений липидного спектра сыворотки крови у экспериментальных животных, подвергнутых интоксикации CCl4, на фоне приема тестируемых растительных продуктов.
Материал и методы
Эксперименты были выполнены на 150 беспородных крысах-самцах массой тела 170-220 г.
Животные содержались в виварии в стандартных условиях. Использование животных в эксперименте проводилось в соответствии с правилами, регламентированными законодательством РФ и рекомендациями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов в научных или иных целях. Подопытные животные были разделены на 6 групп:
1-я группа - контрольная (n=25);
2-я - группа сравнения - животные с моделированием ТПП, вызванного введением подкожно 50% масляного раствора тетрахлорметана 0,5 мл/100 г массы тела 1 раз в сутки в течение 3 дней (n=25);
3-я группа - животные с моделированием ТПП, которым по гастральному зонду вводили масло черного ореха (n=25);
4-я группа - животные с моделированием ТПП, которым вводили масло грецкого ореха (n=25);
5-я группа - животные с моделированием ТПП, которым вводили фармпрепарат "Фосфоглив" (n=25);
6-я группа - животные с моделированием ТПП, которым по гастральному зонду вводили льняное масло (n=25).
Растительные масла и "Фосфоглив" (предварительно содержимое 1 флакона с лиофилизатом разводили в 40 мл стерильной воды для инъекций) вводили внутрижелудочно с 7-х по 30-е сутки эксперимента в количестве 0,2 мл в сутки в утренние часы до основного кормления животных.
Биохимические исследования влияния данных масел на липидный обмен животных выполнялись общепринятыми методами и включали определение содержания в сыворотке крови крыс общего холестерина (ОХС), холестерина липопротеинов высокой (ЛПВП), низкой (ЛПНП) и очень низкой (ЛПОНП) плотности, эфиров холестерина (ЭХС), неэтерифицированного холестерина (НЭХС), ТАГ.
Определение содержания ОХС в сыворотке крови колориметрическим методом Триндера основывается на реакции гидролиза ЭХС холестеринэстеразой с образованием НЭХС. Образовавшийся в результате гидролиза и имеющийся в пробе НЭХС под действием холестеролоксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта.
Интенсивность окраски продукта, определяемая фотоэлектроколориметрически, пропорциональна концентрации содержания ОХС в исследуемой пробе сыворотки крови [13].
Определение содержания ТАГ в сыворотке крови колориметрическим методом Буколо и Дэвида основано на реакции ферментативного гидролиза ТАГ под действием липазы с образованием свободных жирных кислот и глицерина. Под действием глицерокиназы образовавшийся глицерин превращается в глицерол-3-фосфат, который окисляется кислородом воздуха с участием глицерофосфатоксидазы в фосфодиоксиацетон и пероксид водорода. В результате взаимодействия перекиси водорода с 4-аминоантипирином, 4-хлорфенолом и под действием пероксидазы образуется окрашенное вещество хинонимин, концентрация которого в реакционной смеси определяется фотометрически и пропорциональна содержанию ТАГ в исследуемой сыворотке крови [13]. Определение содержания ЭХС и НЭХС в сыворотке крови методом Златкиса-Зака основано на реакции осаждения НЭХС раствором дигитонина. В супернатанте после центрифугирования остаются только ЭХС.
Его концентрацию определяли в соответствии с методикой, приведенной выше. Разница между содержанием ОХС и ЭХС соответствовала концентрации НЭХС в сыворотке крови.
Определение содержания холестерина ЛПВП в сыворотке крови основано на осаждении хиломикронов, ЛПОНП, ЛПНП после добавления к исследуемой пробе сыворотки крови фосфорновольфрамовой кислоты и Mg2+. После центрифугирования реакционной смеси в надосадочной фракции остаются только ЛПВП, концентрация холестерина (ХС) в которых определяется в соответствии с методикой определения ХС в сыворотке крови колориметрическим методом. Расчет содержания ХС ЛПОНП и ХС ЛПНП осуществляли с использованием формул [14]: ХС ЛПОНП (ммоль/л) = ТАГ (ммоль/л)/2,2; ХС ЛПНП (ммоль/л) = ОХС (ммоль/л) - ХС ЛПВП (ммоль/л) - ХС ЛПОНП (ммоль/л).
Анализ липидного спектра биологических жидкостей и тканей проводили методом тонкослойной хроматографии. Для этого в работе были использованы пластины на алюминиевой подложке типов ПТСХ-АФ-В 10×10, ПТСХ-АФ-В 10×15 ("Сорбфил" от ООО "ИМИД", Россия), на которые наносили экстракты липидов эритроцитов.
Для получения экстракта липидов в пробирку вносили 1,0 см3 эритроцитарной массы, 2,5 см3 этанола и после перемешивания содержимого - 5,0 см3 гексана, после чего в пробу добавляли 2,5 см3 дистиллированной воды для удаления нелипидных компонентов. Пробирку закрывали и встряхивали на лабораторном шейкере в течение 5 мин, после чего пробы центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Затем из супернатанта отбирали верхний (гексановый) слой в другую пробирку и выпаривали гексан при 60-700 °С на роторном испарителе до образования сухого остатка. Сухой остаток липидов растворяли в 0,1 см3 хлороформа.
Полученный экстракт липидов эритроцитов использовали для нанесения на хроматографические пластины. Экстракт липидов эритроцитов объемом 10,0 мкл с помощью микрошприца наносили на хроматографические пластины в точки, расположенные на расстоянии 1 см от краев пластины и друг от друга. Для получения компактных стартовых пятен образцы экстракта липидов наносили порционно и подсушивали при 60-70 °С с помощью нагревательного устройства УСП-1М (ТУ 4215-005-45843003-99, ООО "ИМИД", Россия). Затем пластину с нанесенными образцами помещали в хроматографическую камеру, которую предварительно в течение 1 ч насыщали парами растворителя.
Фракционирование общих липидов производили в системе "гексан:диэтиловый эфир:ледяная уксусная кислота" = 35:15:2 (по объему) путем однократного элюирования. Хроматографирование прекращали по достижении фронтом растворителя расстояния 1-1,5 см от верхнего края пластины, после чего ее высушивали в вытяжном шкафу до исчезновения запаха растворителя. Для равномерного окрашивания разделенных компонентов пластины окрашивали путем опрыскивания 5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты по схеме Вальди. Затем окрашенные пластины проявляли в сухожаровом шкафу в течение 5-7 мин при 100-1200 °С. На пластинах проявлялись темно-синие пятна липидов (общих ФЛ и ОХС) на зелено-желтом фоне. Полученные хроматограммы анализировали с помощью программно-аппаратного комплекса - денситометра ("Сорбфил" от ООО "ИМИД", Россия).
Обработку экспериментального материала проводили в соответствии с методами вариационной статистики [15], с использованием пакетов статистических программ Microsoft Exсel и Statistiсa (достоверными считали различия при p<0,05). Оценку достоверности найденных отличий средних величин (M) между группами проводили с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни (для независимых групп).
Результаты и обсуждение
Согласно проведенному нами исследованию, изменения липидного метаболизма у крыс с острым ТПП тетрахлорметаном состояли прежде всего в выраженной гиперхолестеринемии, связанной как с увеличением содержания ОХС по сравнению с контролем на 30,0% (p<0,05), так и с угнетением процессов этерификации ХС (табл. 1).
&hide_Cookie=yes)
Концентрация ЭХС в крови крыс 2-й группы сравнения уменьшилась на 31% (p<0,05), а содержание НЭХС возросло на 129% (p<0,05), что обусловило уменьшение коэффициента ЭХС/НЭХС на 73% (p<0,05) по сравнению с контрольной группой животных (см. табл. 1). При введении крысам с ТПП масел черного и грецкого орехов, льняного масла или препарата "Фосфоглив" проявилась тенденция к уменьшению выраженности нарушений и к нормализации метаболизма липидов в организме. Во всех подгруппах крыс содержание ОХС и НЭХС в сыворотке крови достоверно уменьшилось по сравнению со 2-й группой сравнения.
Наиболее значительное снижение концентрации ОХС на 17,5% и НЭХС на 38,2% наблюдалось у животных, получавших льняное масло.
Изменение в содержании ХС связано с увеличением его содержания в ЛПНП - на 120% (p<0,05), при одновременном снижении ХС во фракции ЛПВП на 45,1% (p<0,05). У подопытных животных имело место формирование вторичной дислипопротеинемии. Основная масса ЭХС образуется под действием фермента лецитинхолестеринацилтрансферазы. Поэтому соотношение ЭХС и НЭХС характеризует активность данного фермента. Низкая активность лецитинхолестеринацилтрансферазы обусловливает накопление НЭХС в липопротеидных частицах крови, изменяя их свойства. Накопление НЭХС в ЛПВП существенно снижает их холестерин-акцепторные возможности, а также изменяет обмен ЭХС между липопротеидными частицами крови. При этом в комплексе ЛПНП+ЛПОНП возрастает относительное содержание НЭХС. Нарушение процессов этерификации ХС на фоне низкой активности лецитинхолестеринацилтрансферазы приводит к торможению обратного транспорта ХС, что вызывает его накопление в организме.
Вероятно, причинами вышеописанных изменений липидного метаболизма являются угнетение процесса этерификации ХС, обусловленное в определенной мере накоплением продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах, и последующее нарушение распределения ХС в липопротеиновых частицах, а также нарушение взаимодействия липопротеинов с клеточными рецепторами и угнетение процесса выведения ХС из организма.
Анализ результатов исследования содержания ТАГ у крыс с ТПП 2-й группы показал достоверное снижение концентрации на 67% (p<0,05) по сравнению с контролем. Снижение содержания ТАГ, вероятно, связано с блокированием синтеза эндогенных ТАГ в печени, являющегося следствием ее токсического поражения. Это подтверждается фактом снижения ХС ЛПОНП во 2-й группе на 66% (p<0,05) по сравнению с контролем (табл. 2).
&hide_Cookie=yes)
Содержание ХС ЛПНП у крыс, получавших исследуемые масла или "Фосфоглив", достоверно уменьшилось по сравнению со 2-й группой крыс.
Наиболее выраженный эффект снижения ХС ЛПНП наблюдался у крыс, получавших льняное масло (на 47,4%) или масло черного ореха (на 40,6%).
В то же время содержание ХС ЛПВП значительно увеличилось. Максимальное увеличение ХС ЛПВП было в подгруппе животных, получавших льняное масло (на 80,1%). Содержание ХС ЛПВП у крыс, получавших масла черного и грецкого орехов, превысило этот показатель по сравнению со 2-й группой на 66,0 и 58,0% соответственно. Содержание ХС в ЛПОНП у крыс, получавших масла черного и грецкого орехов, было больше, чем у животных 2-й группы в 1,9 и в 1,7 раза соответственно, а у крыс, получавших масло льна, - в 2 раза.
Содержание ТАГ в крови животных, получавших масла льна, черного или грецкого орехов, достоверно превысило этот показатель у крыс 2-й группы на 202,0, 195,1 и 178,3% соответственно. У крыс, получавших масла льна, черного или грецкого орехов, уровень ТАГ на 30-е сутки эксперимента статистически не отличался от содержания ТАГ в крови животных контрольной группы. Гепатотоксические эффекты тетрахлорметана опосредуются прежде всего его мембраноповреждающим действием в гепатоцитах, которое связано с воздействием на липидные компоненты мембран. Липиды мембран гепатоцитов очень сложно исследовать в условиях динамического наблюдения в проводимом нами эксперименте. В связи с этим в качестве информационного эквивалента мы использовали мембраны эритроцитов, так как изменения их липидного спектра коррелируют с изменениями, происходящими в мембранах паренхиматозных органов.
Исследование липидов эритроцитов методом тонкослойной хроматографии в подгруппах крыс с экспериментальным ТПП, вызванным введением CCl4, показало, что содержание ФЛ уменьшилось на 46%, а НЭХС увеличилось на 31,2% у крыс 2-й группы по сравнению с контролем, коэффициент НЭХС/ФЛ увеличился на 143%, что позволяет констатировать уменьшение проницаемости мембраны эритроцитов, повышение микровязкости, усиление ее жесткости. При введении липофильных продуктов во всех четырех группах наблюдалось увеличение содержания ФЛ по сравнению с группой крыс (2-й) с ТПП, но не получивших исследуемых веществ растительного происхождения или фармпрепарат "Фосфоглив" (табл. 3).
Наибольшее значение этого параметра оказалось в группе крыс, получавших масло льна (33,87% от содержания всех ФЛ в гемолизате эритроцитов), что на 57,4% (р<0,05) превышает этот показатель в эритроцитах крыс 2-й группы. Минимальное значение содержания ФЛ отмечено в группе животных, которым вводили фармпрепарат "Фосфоглив", которое было выше по сравнению с показателем 2-й опытной группы на 18,1% (р<0,05). В эритроцитах крыс, получавших масло черного или грецкого орехов, данный показатель превышал данные по содержанию ФЛ группы сравнения на 33,5 и 26,5% соответственно (р<0,05).
Анализ показателей содержания в гемолизате эритроцитов НЭХС показал, что в группах крыс, которым вводили масло черного ореха, содержание НЭХС уменьшилось на 5,4%, у получавших льняное масло крыс этот показатель снизился на 16,3% (р<0,05), а в гемолизате эритроцитов животных, получавших масло грецкого ореха, уровень НЭХС уменьшился на 6,1% (р<0,05). Наименее выраженное изменение содержания НЭХС в эритроцитах крыс с интоксикацией СCl4 было выявлено в группе животных, получавших препарат "Фосфоглив", у которых величина этого показателя составила 76,1% от общего количества липидов, что лишь на 3,1% превысило соответствующий показатель у крыс группы сравнения.
Полученные результаты логично объясняют снижение коэффициента НЭХС/ФЛ во всех группах экспериментальных животных, получавших изучаемые вещества, по сравнению с таким же коэффициентом у крыс 2-й группы. Однако во всех подгруппах значение коэффициента НЭХС/ФЛ было существенно больше его величины у контрольной группы крыс. Наиболее выраженное увеличение ФЛ и снижение ХС наблюдалось в группе животных, получавших льняное масло.
Таким образом, результаты исследования позволяют констатировать, что изменения липидного метаболизма в организмах животных, получавших исследуемые растительные масла или препарат "Фосфоглив" на фоне моделирования токсического поражения печени ССl4, были значительно меньшими по сравнению с животными, не получавшими изучаемые вещества.
В 3-4-й группах животных на фоне ТПП при введении масел из плодов грецкого и черного орехов, льняного масла или препарата "Фосфоглив" содержания ОХС, НЭХС и ХС в ЛПНП достоверно уменьшились по сравнению с аналогичными показателями крыс 2-й группы. Наиболее выраженный эффект наблюдался у крыс, получавших льняное масло, - снижение концентрации составило соответственно 17,5% (ОХС), 38,2% (НЭХС) и 47,4% (ХС в ЛПНП).
Под действием исследуемых липофильных продуктов наблюдалось увеличение содержания ХС ЛПВП и ХС ЛПОНП. Максимальное увеличение этих показателей наблюдалось у крыс, получавших масло льна и черного ореха: на 80,1 и 66,0% (ХС ЛПВП); в 2 и 1,9 раза больше группы сравнения (ХС ЛПОНП). Концентрация ТАГ в сыворотке крови животных, получавших масла грецкого, черного орехов и льняное масло, превысила этот показатель у крыс 2-й группы сравнения на 178,3, 195,1 и 202,0% (р<0,05) и приблизилась к концентрации ТАГ в сыворотке крови животных контрольной группы.
При исследовании липидов в гемолизате эритроцитов при ТПП на фоне введения крысам тестируемых веществ отмечалось увеличение содержания общих ФЛ. В эритроцитах крыс, получавших масло грецкого или черного орехов, а также масло льна данный показатель превышал данные по содержанию ФЛ группы сравнения соответственно на 26,5, 33,5 и 57,4% (р<0,05). В гемолизате эритроцитов содержание НЭХС у крыс, получавших масла черного ореха, грецкого ореха и льна, уменьшилось на 5,4, 6,1 и 16,3% (р<0,05) по сравнению с аналогичным показателем 2-й подопытной группы животных.
Заключение
Таким образом, введение масел льна, черного и грецкого орехов оказывает выраженный позитивный эффект на показатели липидного обмена у животных с экспериментальной печеночной недостаточностью, проявившейся в уменьшении зафиксированных патологических изменений, достоверной тенденции к нормализации исследованных параметров функционального состояния организма. Это может послужить основанием для проведения клинических исследований влияния изученных растительных масел в качестве перспективных гепатопротекторов природного происхождения с потенциальной возможностью их использования как в качестве алиментарных факторов, так и действующих начал лекарственных средств, что позволит решить актуальную медико-социальную проблему защиты организма от воздействия токсикантов.
Работа выполнена при поддержке государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации от 28.01.2015 (ч. 1, раздел 1) "Осуществление прикладных научных исследований, в том числе проведение доклинических исследований лекарственных средств и клинических исследований лекарственных препаратов".
Литература
1. Маев И.В., Казюлин А.Н., Кучерявый Ю.А., Маевская Е.А. Заболевания печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. 2012. Т. XXII, № 3. С. 49-56.
2. Белякин С.А., Бобров А.Н., Плюснин С.В. Роль биопсии печени в диагностике алкогольного гепатита // Воен. мед. журн. 2011. № 5. С. 68-69.
3. Шикалова И.А., Шилов В.В., Батоцыренов Б.В., Васильев С.А. и др. Особенности фармакологичеcкой коррекции острых токсических гепатопатий у больных с тяжелыми формами острого отравления алкоголем // Клин. мед. 2012. № 1. С. 60-64.
4. Амосов В.В., Лапин А.А., Марков М.В., Зеленков В.Н. Антиоксидантная емкость водных и водно-спиртовых экстрактов лабазника камчатского (Filipendulakamtschaticamaxim) // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. 2009. № 1. С. 25-26.
5. Дашинамжилов Ж.Б., Лубсайдорясиева П.Б., Лоншакова К.С., Баторова С.М. Гепатозащитное действие лекарственного растительного сбора "Гексахолефит" при повреждении печени этанолом // Пат. физиол. 2008. № 1. С. 25-26.
6. Жаров С.Н., Санин Б.И. Терапия вирусных гепатитов // Леч. врач. 2009. № 2. С. 31-36.
7. Хильчук М.А., Есауленко Е.Е., Ладутько А.А., Быков И.М. и др. Модификация липидного спектра мембран эритроцитов при экспериментальном токсическом поражении печени и возможности его коррекции растительными маслами // Кубан. науч. мед. вестн. 2012. № 1. С. 177-181.
8. Кравченко Л.В., Гладких О.Л., Авреньева Л.И., Тутельян В.А. Исследование антиоксидантных свойств индол-3-карбинола in vitro и in vivo // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. 2008. № 4. С. 18-23.
9. Bykov I.M., Esaulenko E.E., Melkonuan K.I. Metabolic effects of plant origin products in rats with carbon tetrachloride intoxication // Int. J. Immunorehabil. 2014. Vol. 16, N 1. P. 50-51.
10. Быков И.М., Есауленко Е.Е., Сепиашвили Р.И., Хильчук М.А. Оценка эффективности антиоксидантных свойств липофильных продуктов растительного происхождения in vitro липосомальной модельной тест-системы // Фiзiологiчний журн. 2014. Т. 60, № 2. С. 88-92.
11. Есауленко Е.Е., Быков И.М., Курзанов А.Н., Хильчук М.А. и др. Жирнокислотный состав черного (американского) ореха // Липидология - наука XXI века: материалы I междунар. науч.практ. интернет-конф. Казань, 2013. С. 75-78.
12. Есауленко Е.Е., Быков И.М., Курзанов А.Н. Сравнительная оценка метаболической доступности некоторых растительных масел // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 3. Прил. С. 180-181.
13. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М. : МЕДпрессинформ, 2009. 896 с.
14. Fridwald W.T., Levy R.J., Fredrickson D.S. Estimation of the concentration of lowdensitylipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge // Clin. Chem. 1972. Vol. 18. P. 499-502.
15. Герасимов А.Н. Медицинская статистика : учеб. пособие. М. : Медицинское. информационное агентство, 2007. 480 с.