Определение глюкозы, сахарозы и фруктозы методом капиллярного электрофореза
РезюмеИзучены возможности режимов мицеллярного капиллярного электрофореза при использовании отрицательной полярности и электролита щелочного характера для определения глюкозы, сахарозы, фруктозы в экстрактах вегетативных органов растений и продукции переработки плодов и винограда. Проведена сравнительная оценка пределов обнаружения глюкозы, сахарозы, фруктозы для разработанных вариантов электролитов, показаны преимущества и недостатки методики. Рекомендовано использование водного электролита, содержащего 0,5% сорбата калия, 0,62% цетилтриметиламмоний бромида и 0,02% гидроксида калия. Анализируемые компоненты детектировали при 254 нм. Пробу дозировали гидродинамически (30 мбар; 5 с). Рекомендуемое отрицательное напряжение 16 кВ, сила тока должна составлять 54±4 мкА, применяют термостатирование капилляра при 24 °С, время анализа - 15 мин. Пределы обнаружения для фруктозы и глюкозы составляют 0,03 г/дм3 , для сахарозы - 0,07 г/дм3. Линейность сохранялась для каждого компонента до 5,0 г/дм3 включительно. Электрофоретическая подвижность углеводов составила (10-4см2В-1с-1): фруктозы - 3,12, глюкозы - 3,03, сахарозы - 2,74. Ориентировочное время выхода: глюкозы - 13 мин, сахарозы - 13,5 мин, фруктозы - 12,5 мин. Разработанный вариант определения массовой концентрации моно- и дисахаридов обеспечивает полное разделение компонентов. Проведению анализа не мешают анионы, глицерин, этиленгликоль, изомеры пропиленгликоля и бутиленгликоля.
Ключевые слова:капиллярный электрофорез, электролит, сок, сахар, подвижность, предел детектирования, время миграции
Вопр. питания. - 2015. - № 1. - С. 89-94.
Известно, что соки плодового происхождения в основном содержат фруктозу, а виноградные - фруктозу и глюкозу примерно в соотношении 1:1. Изменение соотношений моносахаридов может свидетельствовать о нарушении качества продукта. В связи с этим разработка методов определения концентраций глюкозы и фруктозы при совместном присутствии является важной задачей для реализации контроля качества пищевых продуктов.
Для количественного определения углеводов разработаны многочисленные фотоколориметрические методики, приемы ферментативного анализа, тонкослойной хроматографии, газовой хроматографии или хромато-масс-спектрометрии, жидкостной хроматографии и высокоэффективного капиллярного электрофореза (ВЭКЭ) [18].
Высокоэффективный капиллярный электрофорез - известный способ эффективного решения многих аналитических задач как рутинного, так и исследовательского характера [2, 4-6, 12, 15].
Практическую значимость метода подтверждают действующие и разрабатываемые государственные стандарты России для различных испытаний промышленной и сельскохозяйственной продукции, например ГОСТ Р 52841-2007 "Продукция винодельческая. Определение органических кислот методом капиллярного электрофореза".
Существенным достоинством ВЭКЭ является практическое отсутствие пробоподготовки, в том числе для сложных по компонентному составу материалов биологического происхождения [3], устойчивость внутренней поверхности кварцевого капилляра к агрессивным веществам, за исключением производных фтора, и загрязнению компонентами исследуемых проб [14]. Для определения глюкозы, сахарозы, фруктозы известно несколько методик, реализующих капиллярный электро форез со спектрофотометрическим детектированием [16].
Главной проблемой при электрофоретическом определении глюкозы, сахарозы, фруктозы с УФдетектированием является отсутствие в их молекулах соответствующих химических связей, что приводит к низкой чувствительности детектирования [10]. Исследователи предлагают дериватизацию образцов или получают комплексные производные с хромофорами и поливалентными металлами [13]. Получение производных не всегда оправданно ввиду различной реакционной способности разных углеводов к одному и тому же реагенту, часто происходит образование сложной смеси стереоизомеров, существует определенная трудоемкость процесса [1]. Для растительных экстрактов, содержащих целый комплекс веществ, способных вступать в конкурирующие реакции с сахарами, искажения могут принять неуправляемый характер и понизить достоверность результатов количественного анализа.
Считается, что для определения моно- и дисахаридов наиболее предпочтительно использование косвенного УФ-детектирования в режиме мицеллярной элек трокинетической хроматографии и лигандообменного электрофореза [1, 9, 11], позволяющее достичь требуемых пределов обнаружения при минимальных затратах на сам ход анализа [9, 11]. Непрямое детектирование углеводов в режиме зонного электрофореза было возможно при использовании электролита с высоким значением pH, содержащего сильно поглощающие в УФ-диапазоне или флюоресцирующие анионы: сорбат, триптофан, n-нитрофенол, 1-нафтилацетат [18]. В условиях использования высокощелочного ведущего электролита углеводы приобретают отрицательный заряд, поэтому для анализа используют отрицательное напряжение 25 кВ. В ходе экспериментов установлено, что калибровочная кривая индивидуальных углеводов линейна в диапазоне концентраций от 50 до 10 000 мг/дм3 [17]. Разработан анализ сахарных кислот, получаемых в результате кислотного гидролиза полисахаридов и гликанов, связанных с гликопротеинами [7]. Для количественного анализа методом капиллярного электрофореза простых углеводов, содержащихся в гликопротеинах после дериватизации силилирующими агентами, были применены боратный электролит (pH 9,0) и ЛИФ-детектирование, для анализа использовали положительное напряжение 20 кВ [8].
Материал и методы
Использовали системы капиллярного электрофореза серии "Капель" ("Люмэкс", РФ) со следующими характеристиками: фотометрический детектор (254 нм), кварцевый капилляр с внешним полиамидным покрытием (внутренний диаметр 75×10 -6 м, эффективная длина - 0,5 м, водное термостатирование), центрифуга "Minispin" ("Eppendorf", Германия), 13 000 об/мин, растирочную машину ("Bioreba", Швейцария), рефрактометр ("Atago", Япония). Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения "Мультихром для Windows, версия 1.5" (ООО "Амперсенд", Москва, РФ).
Пробы готовили следующим образом: пробу сока, вина или другого жидкого объекта разбавляли в 2-50 раз (в зависимости от ожидаемого суммарного содержания моно- и дисахаридов, которое следует оценить рефрактометром и разбавить до суммарной концентрации не более 10 г/дм3 ), центрифугировали в течение 3-5 мин при 6000 об/мин. Гомогенизированные плоды, пюре и подобную продукцию заливали дистиллированной водой в соотношении 1:10, перемешивали, настаивали в течение 1 ч при комнатной температуре, центрифугировали, фильтровали, разбавляли дистиллированной водой и подвергали анализу. Фрагменты вегетативных органов растений измельчали на растирочной машине или вручную, количественно переносили в пробирки из полимерных материалов с завинчивающимися крышками, добавляли дистиллированную воду в соотношении по массе 1:10, перемешивали, настаивали в течение нескольких часов при комнатной температуре, затем декантировали.
Результаты и обсуждение
Оптимизация разделения смеси фруктозы, глюкозы, сахарозы получена при использовании водного электролита, содержащего сорбат калия, цетилтриметиламмоний-основание (ЦТАОН), глицерин и гидроксид калия. Сорбат калия использовали для обеспечения поглощения электролита в ультрафиолетовом спектре, глицерин - для уменьшения влияния матрицы пробы и снижения силы тока, ЦТА-ОН - компонент для формирования условий мицеллярного электрофореза. Для обоснования ионной силы раствора и достижения стабильности работы ведущего электролита были проведены эксперименты по влиянию добавления раствора гидроксида калия, оказывающего основное влияние на ионизацию молекул сахаров и разделение компонентов при наложении отрицательного напряжения. Параметром контроля качества разделения углеводов выбрана их электрофоретическая подвижность (рис. 1).
)
Данные рис. 1 показывают, что содержание 0,015% гидроксида калия в составе электролита обеспечивает ионизированное состояние и существенное различие электрофоретической подвижности углеводов и в то же время их постоянное значение, что важно для проведения количественного анализа. Далее было установлено, что уменьшение рН не позволяло разделить анализируемые компоненты, а увеличение рН приводило к значительному увеличению времени анализа, а в итоге и к снижению качества разделения компонентов за счет роста тепловых шумов.
Таким образом, состав электролита может быть рекомендован как оптимальный. Для анализа использовали водный ведущий электролит, содержащий 0,4% сорбата калия, 0,08% ЦТА-ОН, 3,2% глицерина и 0,015% гидроксида калия; электролит расходуют в течение рабочего дня. Анализируемые компоненты детектировали при 254 нм.
Пробу дозировали гидродинамически (30 мбар; 5 с). Рекомендуемое отрицательное напряжение - 16 кВ, при этом сила тока должна составить 45±2 мкА, термостатирование капилляра происходит при +24 °С, время анализа - 15 мин. Перед работой кварцевый капилляр промывали 1 М соляной кислотой и ди стиллированной водой в течение 10 мин, кондиционировали сначала 10 мин 1 М раствором гидроксида калия, затем 10 мин дистиллированной водой. Между анализами капилляр промывали в течение 2 мин 1 М соляной кислотой, дистиллированной водой, 1 М раствором гидроксида калия.
Ориентировочное время выхода: глюкозы - 13,5 мин, сахарозы - 14 мин, фруктозы - 13 мин. Пределы обнаружения оценивали по графику зависимости отношения высот сигнал/шум от концентрации компонента. Концентрация сахара при величине соотношения сигнал/шум >3 соответствует пределу обнаружения соответствующего компонента. Пределы обнаружения для фруктозы и глюкозы составили 0,01 г/дм3 , для сахарозы 0,03 г/дм3 . Линейность сохранялась для каждого компонента до 5,0 г/дм3 включительно. Электрофоретическая подвижность сахаров составила (10-4см2В-1с-1): фруктозы - 2,97, глюкозы - 2,86, сахарозы - 2,66. При выборе напряжения руководствовались степенью разделения компонентов и длительностью анализа. Пример определения сахаров градуировочной смеси показан на рис. 2. Калибровочные растворы готовили на дистиллированной воде из химически чистых препаратов глюкозы, фруктозы, сахарозы.
)
Ввиду значительного содержания в винах и экстрактах растительного сырья глицерина, изомеров пропиленгликоля, бутиленгликоля было проведено исследование их возможного влияния на результаты анализа. В ходе экспериментов установлено отсутствие влияния данных веществ на результаты анализа. Аналогичная работа проведена для учета влияния анионов хлорида, сульфата, бората, фосфата. Установлено, что анионы не проявляются на электрофореграмме в данных условиях анализа и, соответственно, не оказывают влияния на количественное определение глюкозы, фруктозы, сахарозы.
С целью упрощения условий анализа и эксплуатации раствора электролита были проведены дополнительные экспериментальные исследования, которые позволили предложить модифицированные условия выполнения определения сахаров. Вместо относительно дорогого ЦТА-ОН использовали более доступный цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ). Применение ЦТАБ позволило увеличить ионную силу электролита, уменьшить время анализа и в то же время практически не изменить качество условий разделения компонентов. Применение ЦТАБ позволило отказаться от глицерина, так как он гигроскопичен, что приводит к изменениям его массовой концентрации, а это отражается на стабильности условий получения электролита. Следует отметить, что электролит, содержащий ЦТАБ, обладает меньшей чувствительностью для определения компонентов.
В результате проведенной экспериментальной работы для выполнения анализа рекомендовано применение водного электролита, содержащего 0,5% сорбата калия, 0,62% ЦТАБ и 0,02% гидроксида калия (электролит расходуют в течение рабочего дня). Анализируемые компоненты детектировали при 254 нм. Пробу дозировали гидродинамически (30 мбар, 5 с). Рекомендуемое отрицательное напряжение - 16 кВ, при этом сила тока должна составлять 54±4 мкА, применяют термостатирование капилляра при 24 °С, время анализа - 15 мин. Перед началом работы кварцевый капилляр промывали 1 М соляной кислотой и дистиллированной водой в течение 10 мин, кондиционировали 10 мин 1 М раствором гидроксида калия, затем 10 мин дистиллированной водой. Между анализами капилляр промывали в течение 2 мин 1 М соляной кислотой, дистиллированной водой, 1 М раствором гидроксида калия.
Разработанный вариант определения массовой концентрации моно- и дисахаридов обеспечивает полное разделение компонентов. Проведению анализа не мешают анионы, глицерин, этиленгликоль, изомеры пропиленгликоля и бутиленгликоля.
Пределы обнаружения для фруктозы и глюкозы составляют 0,03 г/дм3 , для сахарозы - 0,07 г/дм3 .
Линейность сохранялась для каждого компонента до 5,0 г/дм3 включительно. Электрофоретическая подвижность углеводов составила (10-4 см2 В-1 с-1 ): фруктозы - 3,12, глюкозы - 3,03, сахарозы - 2,74.
При выборе напряжения руководствовались качеством разделения компонентов и длительностью анализа.
Ориентировочное время выхода: глюкозы - 13 мин, сахарозы - 13,5 мин, фруктозы - 12,5 мин.
Пример определения сахаров в пробе виноградного концентрированного сока показан на рис. 3.
)
Данные рис. 3 демонстрируют полное разделение фруктозы, глюкозы, сахарозы образца концентрированного виноградного сока и, соответственно, пригодность разработанного состава электролита для количественного анализа.
Заключение
Таким образом, разработаны экспресс-методики определения массовой концентрации глюкозы, фруктозы, сахарозы посредством ВЭКЭ. Установлено, что количественному анализу в пробах винодельческой продукции, соков, растительного сырья не мешают анионы хлорид, сульфат, нитрат, глицерин, этиленгликоль, изомеры пропиленгликоля и бутиленгликоля. По итогам исследования получен патент РФ № 2 492 458.
Литература
1. Алексеева А.В., Карцова Л.А., Казачищева Н.В. Определение сахаров методом лигандообменного капиллярного электрофореза // Журн. анал. химии. - 2010. - Т. 65, № 2. - С. 205-211.
2. Арианова Е.А., Богачук М.Н., Передеряев О.И. Определение хондроитин сульфата в биологически активных добавках к пище методом капиллярного зонального электрофореза // Вопр. питания. - 2013. - Т. 82, № 3. - С. 67-71.
3. Беленький Б.Г. Высокоэффективный капиллярный электрофорез. - СПб.: Наука, 2009. - 320 с.
4. Богачук М.Н., Передеряев О.И., Бессонов В.В. Определение меламина в молоке и молокосодержащих продуктах методом капиллярного зонного электрофореза // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. - С. 50-54.
5. Богачук М.Н., Бессонов В.В., Передеряев О.И. Методика количественного определения водорастворимых витаминов в витаминных премиксах и пищевых продуктах с использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии на коротком конце капилляра // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. - С. 67-74.
6. Малинкин А.Д., Бессонов В.В., Шумакова А.А. и др. Определение состава основных катионов в соках и нектарах методом капиллярного зонального электрофореза // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 1. - С. 74-79.
7. Campa C., Baiutti E., Flamingmi A. Capillary electrophoresis of sugar acids // Methods Mol. Biol. - 2008. - Vol. 384. - P. 307-355.
8. Chen F.T., Dobaski Th.S., Evangelista R. Quantitative analysis of sugar constituents of glycoproteins by capillary electrophoresis // Glycobiology. - 1998. - Vol. 69, N 11. - P. 1045-1052.
9. Hoffstetter-Kuhn S., Puulus A., Gassman E., Widmer H.M. Determination of sugar by capillary electrophoresis // Anal. Chem. - 1991. - Vol. 63. - P. 1541-1550.
10. Klockow A., Paulus A., Figuereis V. et al. Determination of carbohydrates in fruit juices by capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. - 1994. - Vol. 680, is. 1. - P. 187-200.
11. Lee Y., Lin T.-I. Analysis of sugar by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. B. - 1996. - Vol. 681. - P. 87.
12. Li S.F. Capillary Electrophoresis. - Amsterdam: Elsevier. Sci. Publ., 1992. - 608 p.
13. Lu B., Westerlund D. Capillary electrophoresis of sugar with complexon // Electrophoresis. - 1996. - Vol. 17. - P. 325.
14. O’Flanerty B., Yang W.P., Sengupta S., Cholli A.L. Near-real time detection of impurities in sugar and wine samples: a novel approach. Ass. AVH 7 Symposium. - Reims, 2000. - P. 22.
15. Pesek J.J., Matyska M.T. Etched chemically modified capillaries: Novel separation media for electrophoretic analyses // J. Sep. Sci. - 2004. - Vol. 27. - P. 1285-1291.
16. Rassi Z. Recent developments in capillary electrophoresis of carbohydrates // Electrophoresis. - 1997. - Vol. 18, is. 12-13. - P. 2400-2407.
17. Sogaa T., Serweb M. Determination of carbohydrates in food by capillary electrophoresis with indirect UV detection // Food Chem. - 1997. - Vol. 69, is. 3. - P. 339-344.
18. Suzuki Sh., Honda S. A tabulated review of capillary electrophoresis of carbohydrates // Electrophoresis. - 1998. - Vol. 19, is. 15. - P. 2539-2560.