Effect of Coenzyme Q10 supplementation on apoptosis, free radical oxidative processes and proteome pool of microsomal and citozolic fractions of rat hepatocytes during modification of ration lipid component

Abstract

Our aim was to analyze biochemical mechanism in regulation and adaptation

to feeding with ω-3 and ω-6 PUFA plus coenzyme Q10-based diet in rats. The rats were supplemented with Co Q10 (100 mg/kg b.wt.) for 12 month. Male rats were fed a control, control + Q10, fish oil + Q10 palm oil + Q10 and flax oil + Q10 diet. The learning and tests were monitored in 1st, 3rd, 6th and 12th month after the start of feeding. There was studied the content of lipid peroxidation products in the liver, the level of their potential substrates polyunsaturated fatty acids of ω-3 and ω-6 families and MEC (metabolism effectiveness coefficient) index value. Growth of relative number of hepatocyte in the state of late apoptosis has been detected in rats receiving fish oil, linseed oil and palm oil as compared to the control group at the age of 1 and 3 months. In later period no differences in the invested indices, that can be the result of impact of CoQ10 and adaptation of organism to diet. Proteomic studies of microsomal fraction of hepatocytes in rats have found differences in the manifestation of catalase and cetochrome b5, associated both with age of animals and type of fat in diet. Proteomic analysis of cytosolic fraction revealed the expression of c-type lectin in the later stages of ontogeny. The levels of lipid peroxidation markers obtain to minimum at 3 month in serum and at 6 month in liver. The specific proteomic changes of influence of diet composition were identified during the research.

Keywords:coenzyme СoQ10, hepatocytes, free radical oxidation

Вопр. питания. - 2012. - № 5. - С. 51-59.

Известно, что жировой компонент рациона, в частности содержание в нем полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), в значительной мере влияет на функциональное состояние организма. Дефицит и изменение состава указанных кислот в рационе способны вызывать нарушения функциональных свойств и структурного строения различных органов и тканей организма, в том числе мембран клеток их паренхимы [3, 9, 12]. Дефицит или незначительное содержание ПНЖК прежде всего сказываются на процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ), индукция которого, как показали многочисленные исследования [13, 24, 28], может возникать в организме даже при незначительном изменении в нем состава липидов. В свою очередь, повышенное содержание в пище ПНЖК повышает в организме уровень потенциальных субстратов ПОЛ. Все эти изменения в составе липидов рациона и, естественно, в органах и тканях организма могут привести к нарушению состояния липидного каркаса клеточной мембраны и ее разрушению [3, 9, 12]. Иными словами, в результате изменения состава липидов рациона в организме может увеличиться индукция ПОЛ [13, 17, 24, 28]. В механизме адаптации организма к данному состоянию активное участие на клеточно-молекулярном уровне принимают липид-транспортная, иммунная, гепатобилиарная, прооксидантная и антиоксидантные системы. При этом существенное значение имеет обеспеченность организма антиоксидантами.

Одним из самых активных антиоксидантов является витаминоподобное соединение коэнзим КоQ10 (КоQ10) - естественный участник обмена веществ во всех тканях животных и человека, причем в наибольших количествах в органах и тканях, обладающих высокой метаболической активностью (сердце, почки, печень, мышцы) [29]. Биологическое воздействие КоQ10, содержащегося в оболочках тех клеточных структур, в которых синтезируется АТФ [10, 21], основывается на его способности к обратимым окислительно-восстановительным превращениям. КоQ10 участвует в переносе электронов и водорода по дыхательной цепи и стимулирует процессы окислительного фосфорилирования в клетке. По сравнению с такими антиоксидантами, как витамин Е, А, β-каротин, которые, выполнив свою функцию, теряют активность, КоQ10 способен регенерироваться организмом [1] и участвовать в процессе уменьшения содержания в клетке свободных радикалов. Показано также, что введение КоQ10 в дополнение к основному рациону наряду с другими антиоксидантами оказывает геропротекторный эффект [18, 19, 31].

Метаболические пути, регулирующие энергетический статус клетки, строго скоординированы и сопряжены с путями факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов. Энергетические потоки в клетке координируются с помощью идентифицированного белкового комплекса - киназы mTOR (mammalian Target of RКоQ10 apamyein), которая осуществляет взаимодействие нутриентов с факторами инициации синтеза белка [22]. Проведенные на генном уровне исследования свидетельствуют о действии нутриентов, определяющих энергетический статус клеток, на экспрессию генов. ПНЖК семейств ω-3 и ω-6 контролируют генную экспрессию в различных тканях [8, 26, 30].

Регуляция генной экспресии ПНЖК осуществляется через взаимодействия со специфическими и неспецифическими лигандами. Последние действуют на цис-регуляторные элементы гена и апоптоз клеток, который является нормальным физиологическим процессом с характерными морфологическими признаками изменений ядра и цитоплазмы и характеризуется прежде всего межнуклеосомными разрывами ДНК. Оценка интенсивности апоптоза клеток внутренних органов, в частности гепатоцитов печени, позволяет оценить степень раннего апоптоза и общее число апоптических клеток [11].

Каждая клетка организма содержит одинаковую генетическую информацию, и именно функционирование белков определяет ее специфичность. Набор белков в данной клетке в определенный момент времени определяется понятием протеом.

Протеом не остается постоянным - это гибкая система, способная реагировать на различные изменения в организме и меняться под воздействием внешних и внутренних факторов, поэтому изучение изменений протеома дает возможность выявить основные признаки, указывающие на характер воздействий [16, 20].

Целью настоящего исследования было изучение отдельных биохимических закономерностей регуляции и адаптации организма в зависимости от различного состава жирового компонента экспериментальных рационов и длительности содержания на них подопытных животных. На фоне включения в рацион модулятора энергетического гомеостаза КоQ10 также планируется изучить протеомные особенности микросомальной и цитозольной фракций печени, интенсивность апоптоза, содержание продуктов ПОЛ в печени, коэффициент эффективности метаболизации жирных кислот (КЭМ), характеризующий эффективность синтеза специфичных для мембран жирных кислот из алиментарных предшественников.

Материал и методы

Для проведения экспериментальных исследований были использованы крысы - белые беспородные самцы, выведенные в питомнике ФГБУ "НИИ питания" РАМН, с исходной массой тела 90-110 г. Животных содержали на стандартном полусинтетическом рационе, в состав которого входили казеин (источник белка - 23% по калорийности), крахмал маисовый (источник углеводов - 52%), жировой компонент (23% по калорийности), смесь минеральных солей; в качестве пищевых волокон использовались пшеничные отруби. КоQ10 вводили в рацион из расчета 100 мг на 1 кг массы тела животных.

В зависимости от вида жира были сформированы 5 групп животных (табл. 1): 1-я группа - контрольная [лярд и подсолнечное масло (1:1)], а также 4 опытные: лярд и подсолнечное масло + Q10 (2-я группа), пальмовое масло (ПМ) + Q10 (3-я группа), рыбий жир (РЖ) + Q10 (4-я группа), льняное масло (ЛМ) + Q10 (5-я группа). В количествах, соответствующих физиологическим нормам, животные получали водорастворимые витамины в составе сухих пивных дрожжей и жирорастворимые витамины А, D и Е в составе подсолнечного масла, добавляемого в рацион в каждой группе. Продолжительность эксперимента составила 12 мес. Для установления влияния времени пребывания животных на рационах на изучаемые показатели часть животных из всех групп отбирали через 1, 3, 6 и 12 мес эксперимента, затем под легким эфирном наркозом их умерщвляли путем декапитации и забирали для исследования печень и кровь.

Наряду с общими биохимическими исследованиями методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе "Carloerba strumentazione HRGC 5300" с использованием фазы DB-23 (фирма "Agilent Technologies", США) и программноаппаратного комплекса "МультиХром for Windows" был изучен состав жирных кислот печени [14], определен КЭМ [2], позволяющий оценить степень обеспеченности организма пластическим материалом.

Хроматографическое определение КоQ10 проводили по ранее описанной методике [5]. Интенсивность процессов ферментзависимого ПОЛ оценивали по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови и печени животных [23]. Активность фермент-независимых процессов ПОЛ (определение F2-изопростанов в сыворотке крови) исследовали с использованием ИФА-наборов для лабораторных крыс (ImmunoDiagnosticSystems Ltd., Великобритания). Апоптоз гепатоцитов крыс исследовали методом проточной цитометрии [4], учитывая число живых клеток, клеток в ранней и поздней статидиях апоптоза, а также их общее число в апоптозе. Протеомное исследование микросомальной и цитозольной фракций гепатоцитов крыс проводили в соответствии с методом, описанным ранее [6].

Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни для независимых переменных. Значимость различия долей оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при р<0,05.

Таблица 1. Характеристика жирового компонента рационов, содержание и соотношение в них полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) семейств ω-6/ω-3

Результаты и обсуждение

Рассматривая КоQ10 как регулятор энергетического гомеостаза, изучали его концентрацию в печени крыс различных возрастных групп, получавших контрольный рацион и тот же рацион в сочетании с КоQ10 (табл. 2). На основании полученных результатов была выявлена зависимость этого показателя от продолжительности эксперимента.

Из полученных результатов следует, что вплоть до 6-го месяца жизни в группах животных, получавших КоQ10, его концентрация в печени была стабильно выше, чем в контроле (в среднем в 2 раза; p≤0,05), а к 12-му месяцу - только на 54%. Отмеченная динамика свидетельствует о том, что с увеличением сроков эксперимента в условиях активации процессов свободнорадикального окисления потребность в КоQ10 возрастает.

Анализ показал, что содержание КоQ10 в печени животных зависит не только от вида жирового компонента рационов, но и от продолжительности нахождения животных на экспериментальном рационе. Через 1 мес эксперимента содержание КоQ10 в печени животных было значительно больше, чем через 12 мес. Максимальным содержание КоQ10 было у животных контрольной, 3-й и 4-й групп, получавших ПМ в сочетании КоQ10. У животных этой группы величина КоQ10 была выше (62,6 мкг/мл), чем у получавших на фоне КоQ10 РЖ или ЛМ (соответственно 50,7 и 40,3 мкг/мл). Через 3 мес эксперимента отмечен самый низкий уровень КоQ10 в печени животных последних 2 групп, что, очевидно, объясняется большей активностью и значительной востребованностью КоQ10 как источника энергии и антиоксиданта в метаболических процессах. Можно предположить, что наблюдаемое через 12 мес эксперимента увеличенное по сравнению с контролем содержание КоQ10 в печени животных, получавших в рационе ПМ, связано с низким содержанием в этом масле ПНЖК. По-видимому, в этих условиях организму требуется повышенное содержание КоQ10. Теми же обстоятельствами, очевидно, можно объяснить повышенное по сравнению с контролем содержание в печени данного коэнзима у животных, получавших рационы с РЖ и ЛМ, которые, как известно, содержат небольшое количество ПНЖК семейства ω-6. Стабильные величины показателя КЭМ в печени животных этих групп также могут быть связаны с влиянием КоQ10.

Таблица 2. Содержание КоQ10 (в мкг/кг) и коэффициент эффективности метаболизации жирных кислот в печени животных в зависимости от срока их пребывания на рационах с различным жировым компонентом (M±m)

Таблица 3. Содержание полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) семейства ω-3 в печени, а также диеновых конъюгатов (ДК), малеинового диальдегида (МДА) и F2isoPr в сыворотке и печени крыс (M±m)

В табл. 3 представлены данные о содержании в организме животных ПНЖК семейства ω-3 и ТБК-активных продуктов в зависимости от продолжительности эксперимента. Содержание ПНЖК семейства ω-3 было наивысшим у животных, получавших РЖ и ЛМ в течение 3 мес. Увеличение пребывания крыс на рационе до 6 мес приводит к уменьшению содержания ТБК-активных продуктов во всех группах, что напрямую связано со снижением потенциальных субстратов ПОЛ. Более длительное пребывание животных на рационах с различными источниками жира нивелировало содержание продуктов ПОЛ в печени, что можно объяснить влиянием КоQ10, проявляющего свои антиоксидантные свойства и тормозящего процессы ПОЛ в организме.

Результаты исследования апоптоза гепатоцитов крыс представлены в табл. 4. У крыс, получавших РЖ и ЛМ в течение 1 мес, в гейте гепатоцитов обнаружено достоверное снижение по сравнению с контролем относительного числа живых клеток и, соответственно, повышение относительного числа клеток в состоянии апоптоза. Потребление крысами в течение 3 мес испытуемых рационов не приводит в гейте гепатоцитов к статистически достоверным различиям в содержании живых клеток. Однако при этом следует отметить, что у крыс, получавших рационы с ПМ, РЖ и ЛМ, увеличивается (по сравнению с контролем) относительное число гепатоцитов, находящихся в состоянии позднего апоптоза. Общая же численность гепатоцитов, пребывающих в состоянии апоптоза, была достоверно превышена только у животных, получавших РЖ.

Через 6 мес эксперимента у крыс всех опытных групп не обнаружено статистически достоверных различий по сравнению с контрольными животными в относительном содержании в гейте гепатоцитов живых клеток и клеток, находящихся в состоянии апоптоза. Эта же закономерность прослеживается и через 12 мес эксперимента.

Таким образом, содержание крыс на рационах с различным видом жирового компонента оказывает определенное влияние на степень апоптоза гепатоцитов. Рационы с РЖ и ЛМ в течение 1 и 3 мес эксперимента негативно воздействовалина гепатоциты, что проявлялось в уменьшении относительного числа живых клеток и увеличении численности гепатоцитов, находящихся в состоянии апоптоза. РЖ и ЛМ являются источниками ПНЖК семейства ω-3, которые, как установлено, обладают в условиях in vitro и ex vivo свойствами индукторов апопотоза клеток, изменяя трансмембранный потенциал митохондрий, вызывая гипоэкспрессию антиапоптогенных белков семейства bcl-2 и индукцию экспрессии Fas-лиганда [7, 25, 27]. В качестве патогенетического фактора рассматриваются гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот и свободные радикалы, участвующие в ПОЛ - алкильные радикалы, алкоксильные и диоксид-радикалы [15].

Таблица 4. Апоптоз гепатоцитов крыс, получавших на фоне рационов с различным жировым компонентом коэнзим Q10

Через 6 и 12 мес эксперимента все исследованные показатели у крыс опытных групп не отличались от показателей в контроле. Это служит свидетельством адаптации организма к характеру питания и влияния КоQ10 на степень апоптоза в условиях длительного эксперимента.

При исследовании микросомальной фракции гепатоцитов крыс (табл. 5) удалось выявить проявление каталазы через 3, 6 и 12 мес опыта в группе, получавшей в составе рациона лярд, подсолнечное масло в сочетании с КоQ10. При этом данный белок не был идентифицирован ни у животных контрольной группы, ни у получавших рационы с измененным жировым компонентом. Как известно, каталаза является первым звеном ферментативной антиокислительной защиты, усиливая разложение перекиси водорода до воды, разделяя эту функцию с глутатионпероксидазой.

Следует отметить характерную особенность в проявлении цитохрома b5 у крыс всех исследуемых групп. Так, у контрольных животных и у получавших РЖ указанный белок был обнаружен на поздних сроках (6 и 12 мес), в то время как у получавших лярд, подсолнечное масло в сочетании с КоQ10 или находившихся на рационе с ПМ он был идентифицирован через 1, 3 и 6 мес эксперимента. Цитохром b5 играет важную роль в метаболизме эндогенных и экзогенных соединений ферментами системы цитохрома Р450, локализованными в различных органах и тканях.

Интересным наблюдением стало выявление в микросомальной фракции гепатоцитов крыс 2-й группы, получавших в течение 1, 3 и 6 мес лярд, подсолнечное масло в сочетании с КоQ10, гомогентизат-1,2-диоксигеназы. Это белок катализирует превращение фенилаланина и тирозина с образованием малонилацетоацетата гомогентизиновой кислоты, поскольку превращение фенилаланина в тирозин необходимо прежде всего для удаления избытка фенилаланина, так как высокие его концентрации токсичны для клеток.

При анализе протеомного состава цитозольной фракции гепатоцитов крыс контрольной и опытных групп было обнаружено, что экспрессия лектина С-типа наблюдалась у животных всех групп преимущественно на поздних сроках эксперимента. Однако в группе контроля данный белок был обнаружен через 1, 3 и 6 мес исследования. Известно, что лектины С-типа принимают участие в иммунных реакциях в процессе апоптоза, кроме того, они могут индуцировать в клетках синтез цитокинов и активных форм кислорода.

Экспрессия ras-связанного белка Rab-14 была установлена в ранние сроки эксперимента (1 мес) у животных из группы контроля и у получавших ЛМ сохранялась до 12 мес эксперимента только у контрольных животных. Белки rab принадлежат к группе низкомолекулярных GTP-связывающихся белков, относящихся к семейству RAS-белков, участвуют в транспорте белков. Эти белки регулируют внутриклеточный транспорт мембранных структур. Семейство повсеместно распространенных RAS-белков (млекопитающие, насекомые, дрожжи, нематоды) регулирует различные аспекты клеточной пролиферации, дифференцировки и морфологии. Они являются протоонкогенами: постоянная их активация ведет к злокачественному перерождению клеток.

Протеомная характеристика цитозольной фракции гепатоцитов крыс исследуемых групп выявила также экспрессию субъединицы протеасомного комплекса, задействованного в расщеплении антигенов до пептидов на ранних сроках эксперимента (1-6 мес) у контрольных животных. В то же время у животных 2-й группы, получавших лярд, подсолнечное масло совместно с КоQ10, она включалась только через 3 мес эксперимента и не идентифицировалась у животных, находившихся на рационах с измененным жировым компонентом.

Таблица 5. Характеристика протеомных особенностей микросомальной фракции гепатоцитов крыс, получавших коэнзим Q10 на фоне рационов с измененным жировым компонентом

В ходе исследования циклинзависимая киназа 5 (Cdk5) была выявлена через 1 мес эксперимента у животных 2-й группы, получавших лярд, ПМ в сочетании с КоQ10, а также у животных, находившихся на рационе с ПМ. При этом у животных последней группы экспрессия сохранилась до 3 мес эксперимента. Cdk5 является несвойственным участником широко распространенного семейства циклинзависимых киназ (Cdks). В отличие от остальных Cdks она активируется нециклиновыми белками р35 и р39. Cdk5 фосфорилирует ряд белков, причем большинство из них входит в состав клеточных морфологических структур.

F-box белок идентифицирован на последних сроках эксперимента в цитозольной фракции гепатоцитов крыс, получавших в составе рациона лярд, подсолнечное масло совместно с КoQ10, а также при сроке опыта 1 мес - у крыс, содержавшихся на рационе с добавлением РЖ и ПМ. Этот белок является регуляторным и входит в состав убиквитинлигазного комплекса SCFCOI1 (Skp1 + Cullin + F-box-protein), участвующего в деградации белков с помощью убиквитина в 26S-протеасоме. Через F-box-белок осуществляется перенос убиквитина на фосфорилированные регуляторные белки.

Проведенные экспериментальные исследования выявили, что отмеченные выше изменения в значительной мере связаны с продолжительностью сроков эксперимента: чем он больше, тем в условиях активации процессов свободнорадикального окисления требуется большее количество КоQ10 в печени. Наибольшее содержание ПНЖК семейства ω-3 обнаруживается в печени через 3 мес эксперимента у животных, получавших РЖ и ЛМ. Через 6 мес опыта уровень ТБК-активных продуктов, как и потенцильных субстратов ПОЛ, понижается, что может быть связано с антиоксидантным влиянием КоQ10, тормозящим процессы ПОЛ в организме.

Результаты исследования апоптоза гепатоцитов крыс через 1 и 3 мес эксперимента не выявили в гейте гепатоцитов статистически достоверных различий в содержании живых клеток. При этом у крыс, получавших ПМ, РЖ и ЛМ, отмечено возрастание относительного числа гепатоцитов в стадии позднего апоптоза. Через 6 и 12 мес эксперимента различий в изучаемых показателях не наблюдалось, что может быть связано с влиянием КоQ10 и адаптацией животных к характеру питания.

Исследования микросомальной фракции гепатоцитов крыс обнаружили различия в активности каталазы и цитохрома b5, связанные как со сроком эксперимента, так и с видом жирового компонента в рационе. Протеомный анализ цитозольной фракции гепатоцитов крыс выявил экспрессию лектина С-типа на поздних сроках опыта. Экспрессия ras-связанного белка Rab-14, регулирующего внутриклеточный транспорт мембранных структур, была установлена в ранние сроки эксперимента у контрольных крыс и получавших ЛМ. У животных контрольной группы, находившихся на рационе с ПМ через 1 мес эксперимента выявлена экспрессия циклинзависимой киназы 5(Сdk5), связанной с морфологической структурой клеток. В цитозольной фракции гепатоцитов крыс, получавших в рационе лярд, подсолнечное масло в сочетании с КоQ10 на последних сроках опыта, а также у крыс, находившихся на рационах с на РЖ и ПМ, в первые месяцы эксперимента идентифицирован F-box белок, участвующий в процессах фосфорилирования. Таким образом, в результате проведенного исследования получены данные о формировании специфичных нутрипротеомов микросомальной и цитозольной фракций гепатоцитов крыс при изменении состава рациона.

Литература

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

2. Покровский А.А., Левачев М.М., Гаппаров М.М. // Вопр. питания. - 1973. - № 4. - С. 3-11.

3. Титов В.Н. Атеросклероз как патология полиеновых жирных кислот. Биологические основы теории атерогенеза. - М.: Алтус, 2002. - 495 с.

4. Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Гусева Г.В. и др. // Вопр. питания. - 2011. - № 2. - С. 16-19.

5. Шаранова Н.Э., Батурина В.А., Васильев А.В. и др. // Бюл. экспер. биол. - 2011. - Т. 151, № 6. - С. 624-662.

6. Шаранова Н.Э., Васильев А.В., Гаппаров М.М.Г. // Бюл. экспер. биол. - 2011. - Т. 152, № 12. - С. 658-661.

7. Arita K., Kobuchic H., Utsumia T. et al. // Biochem. Pharmacol. - 2001. - Vol. 62. - P. 821-828.

8. Clarke S.D., Jump D.B. // Annu. Rev. Nutr. - 1998. - Vol. 14. - P. 8 3 - 9 8 .

9. Fernandez M.L., West K.L. // J. Nutr. - 2005. - Vol. 135. - P. 2 0 7 5 - 2 0 7 8 .

10. Geng A.L., Guo Y.M. // Br. Poult. Sci. - 2005. - Vol.46, N 5. - P. 6 2 6 - 6 3 4.

11. Giorgadze S., Gujabidze N., Tevzadze N. et al. // Georgian Med. News. - 2009. - Vol. 174, N 9. - P. 88-91.

12. Hu F.B., Manson J.E., Willett W.C. // J. Am. Coll. Nutr. - 2001. - N 20. - P. 5-10.

13. Ibrahim W., Lee U.S. // J. Nutr. - 1997. - Vol. 127, N 7. - P. 14 0 1-14 0 6 .

14. IUPAC 2.301, 2.302 Standard methods for the analysis of oils fats and derivates. - Pergamon Press, 1979. - P. 9 6 -10 3 .

15. Johnson P., Boldyrev A. Oxidative stress at molecular, cellular and organe levels. - Trivandrum (India): Research Singpost Publ, 2002. - 142 p

16. Kitajka K., Sinclair A.J. // PNAS 101. - 2004. - Vol. 30. - P. 10931-10936.

17. Laemli U.R. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-683.

18. Lake B.G. Biochem. Toxicol. A Practical Approach. - Oxford, 1987. - 219 p.

19. Lass A., Kwong L., Sohal R.S. // Biofactors. - 1999. - Vol. 9, N 2-4. - P. 199-205.

20. Lee C.H., Mizusawa H., Kakefuda T. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1981. - Vol. 78, N 5. - P. 2838-2842.

21. Marriage B.J., Clandinin M.T., Macdonald I.M. et al. // Mol. Genet. Metab. - 2004. - Vol. 81, N 4. - P. 263-272.

22. Moore Т., Beltran L., Carbajal S. et al. // Cancer Prev. Res. (Phila Pa). - 2008. - Vol. 1, N 1. - P. 206-211.

23. Ohkawa H., Onishi Y., Yagi K. // Analyt. Biochem. - 1979. - Vol. 95. - P. 351-358.

24. Piche L.A. Draper H.H., Colf P.D. // Lipids. - 1988. - Vol. 23. - P. 370-371.

25. Reddy A., Zaman A., Lawrence K., Fernandes G. // Lipids. - 1999. - Vol. 34. - P. 921-927.

26. Sessler A.M., Ntambi J.M. // J. Nutr. - 1998. - Vol. 128. - P. 923-926.

27. Switzer K., McMurray D., Morris J., Chapkin R. // Nutrit. Immunol. - 2003. - Vol. 45. - P. 147-153.

28. Tres A., Bou R. // J. Agric. Food Chem. - 2008. - Vol. 56, N 16. - P. 7 24 3 -7 2 5 3 .

29. Turunen M., Olsson J., Dallner G. // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - Vol. 1660, N 1-2. - P. 171-199.

30. Wahle K.W.J., Rotondo D. // Ann. Rev. Nutr. - 2003. - Vol. 62. - P. 3 4 9 - 3 6 0 .

31. Yan J., Fujii K., Yao J. et al. // Exp. Gerontol. - 2006. - Vol. 4, N 1 (2). - P. 130-140.